李欣，孟靜，任瑞，管翠平，馮超林，陳曼曼

(1 山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟(jì)南 250000；2 山東省胸科醫(yī)院)

關(guān)鍵字：子宮內(nèi)膜癌；長鏈非編碼RNA重編程調(diào)節(jié)物；微小RNA-29a；臨床分期

子宮內(nèi)膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，美國癌癥協(xié)會報道美國2015年約有5.5萬例新發(fā)病例，死亡例數(shù)達(dá)1.1萬例，且發(fā)病率和病死率有逐漸增加的趨勢，嚴(yán)重危害女性患者的健康[1]。目前子宮內(nèi)膜癌的治療包括手術(shù)治療、放化療及內(nèi)分泌治療等方式，但對晚期患者，術(shù)后仍有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，患者5年生存率低于30%[2]。因此需深入研究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病和疾病發(fā)展的機(jī)制，尋找新的關(guān)鍵的診斷治療靶點(diǎn)。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是長度大于200個核苷酸的RNA分子，具有結(jié)合靶基因啟動子區(qū)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)及結(jié)合mRNA抑制翻譯過程等生物學(xué)功能[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA在炎癥、腫瘤、心血管疾病及自身免疫等多種疾病中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用，有望成為疾病診斷治療的生物學(xué)標(biāo)志物[4]。研究表明，腫瘤細(xì)胞中LncRNA重編程調(diào)節(jié)物(ROR)表達(dá)升高，能促進(jìn)MYC等癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖并抑制凋亡[5]。miRNA長度為18～25個核苷酸，成熟的具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)miRNA參與構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，調(diào)控靶基因mRNA翻譯。miR-29家族包括miR-29a、miR-29b、miR-29c三個成員，miR-29a在卵巢癌、腎癌及膀胱癌等多種腫瘤中表達(dá)下降，導(dǎo)致對Bcl-2等抑癌基因表達(dá)抑制減弱，促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移及浸潤等[6]。miR-29a受轉(zhuǎn)錄后水平精細(xì)調(diào)控，如LncRNA-MIAT能與miR-29a相互作用，影響下游癌基因如組蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[7]。國內(nèi)有學(xué)者亦報道LncRNA ROR表達(dá)與miR-29a表達(dá)之間存在一定相關(guān)性[8]。本研究通過檢測85例子宮內(nèi)膜癌患者血清中LncRNA ROR與miR-29a的表達(dá)水平，初步探討兩者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年3月～2019年3月在山東大學(xué)第二醫(yī)院診治的85例子宮內(nèi)膜癌患者(癌癥組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①子宮內(nèi)膜癌患者均經(jīng)病理學(xué)檢查明確確診為子宮內(nèi)膜癌；②患者的臨床病理資料及隨訪資料完整；③患者均為初次診治，既往未接受過放化療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有嚴(yán)重的心肝腎等臟器功能不全；②合并其他器官系統(tǒng)的惡性腫瘤；③患者處于孕期或者哺乳期。癌癥組患者年齡29～72(49.1±10.1)歲；病理類型：子宮內(nèi)膜樣腺癌62例，黏液/漿液性腺癌23例；腫瘤直徑：≤5 cm者49例，>5 cm者36例；分化程度：高分化25例，中分化27例，低分化33例；參考2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟FIGO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期[9]，Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ～Ⅳ期28例；肌層浸潤深度：淺肌層60例，深肌層25例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例。以同期診治的40例子宮肌瘤患者作為對照組，年齡28～69(49.3±9.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查明確診斷為子宮肌瘤；②既往未接受過其他治療。癌癥組與對照組年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 血清中LncRNA ROR與miR-29a相對表達(dá)量檢測 采用qRT-PCR法檢測所有研究對象術(shù)前血清中的LncRNA ROR、miR-29a。抽取研究對象清晨空腹靜脈血標(biāo)本5 mL，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，取上清血清-80 ℃保存待測。提取血漿中總RNA：取約300 μL樣品，按TRIzol和樣品體積比例3∶1加入TRIzol，混勻后靜置5 min，加入200 μL氯仿沉淀蛋白，混勻后靜置10 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上層水相加入異丙醇500 μL沉淀RNA，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，去上清保留底部白色沉淀RNA，75%乙醇洗滌RNA，4 ℃下7 500 r/min離心5 min，吸棄上清，室溫下干燥RNA，50 μL的DEPC水溶解，并鑒定RNA的濃度及純度。以1 μg RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實驗步驟嚴(yán)格按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，得到的cDNA 4 ℃保存。qRT-PCR反應(yīng)體系為cDNA 0.2 μL，2×SYBR 5 μL，ROXⅡ 0.2 μL，上游和下游引物各0.5 μL，RNA-free水3.6 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，變性退火延伸共40個循環(huán)。LncRNA ROR正向引物序列：5′-CCAGGACAATGAAACCAC-3′，反向引物序列：5′-AGGAGCCCAAAGTAACAG-3′；內(nèi)參基因GAPDH正向引物序列：5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，反向引物序列:5′-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3′。miR-29a正向引物序列：5′-CTGAGTTTCTATTTAGACACTACAACA-3′，反向引物序列：5′-ACAATTTGACATGTGGCATTAACG-3′；內(nèi)參基因U6正向引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清LncRNA ROR、miR-29a表達(dá)比較 癌癥組血清中LncRNA ROR、miR-29a的相對表達(dá)量分別為1.86±0.23、0.60±0.14，對照組分別為1.09±0.17、1.27±0.22，癌癥組血清中LncRNA ROR的相對表達(dá)量高于對照組(t=18.870，P=0.000)，癌癥組血清中miR-29a的相對表達(dá)量低于對照組(t=20.615，P=0.000)。癌癥組血清中LncRNA ROR、miR-29a的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.634,P=0.001)。

2.2 癌癥組患者血清中LncRNA ROR、miR-29a表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 癌癥組患者血清中LncRNA ROR、miR-29a表達(dá)與腫瘤臨床分期有關(guān)(P均<0.05)，而與年齡、病理類型、腫瘤大小、分化程度、肌層浸潤深度、是否伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

2.3 血清LncRNA ROR、miR-29a單獨(dú)及聯(lián)合檢測對子宮內(nèi)膜癌的診斷價值 血清LncRNA ROR診斷子宮內(nèi)膜癌的ROC曲線下面積為0.762(95%CI：0.676～0.859)，截斷值為1.4時，診斷子宮內(nèi)膜癌的敏感度為0.753，特異度為0.701，約登指數(shù)為0.454；血清miR-29a診斷子宮內(nèi)膜癌的ROC曲線下面積為0.805(95%CI：0.794～0.917)，截斷值為1.0時，診斷子宮內(nèi)膜癌的敏感度為0.780，特異度為0.748，約登指數(shù)為0.528。采用臨床實用的綜合聯(lián)合診斷模式：仍使用兩指標(biāo)各自的診斷閾值，兩指標(biāo)同為陽性或陰性時做陽性或陰性診斷，否則進(jìn)行復(fù)測。若復(fù)測結(jié)果不變，則結(jié)合專業(yè)實踐及醫(yī)師觀點(diǎn)進(jìn)行診斷并側(cè)重考慮miR-29a指標(biāo)(其敏感度和特異度均較高)。兩者聯(lián)合診斷的敏感度為0.824，特異度為0.800，約登指數(shù)為0.624。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是起源于子宮內(nèi)膜上皮組織的惡性腫瘤。隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率亦有逐漸增加的趨勢。子宮內(nèi)膜癌的病因尚不清楚，肥胖、糖尿病及高血壓是子宮內(nèi)膜癌重要的危險因素。子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制是學(xué)者研究的熱點(diǎn)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，而癌基因的激活、抑癌基因的失活、染色體雜合性缺失、染色質(zhì)構(gòu)象的改變等機(jī)制均參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展的過程[10]。近年來新的放化療等輔助治療的發(fā)展改善了子宮內(nèi)膜癌的治療效果，但部分患者術(shù)后仍有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。因此，有必要深入研究子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子生物標(biāo)志，尋找具有臨床意義診斷治療靶點(diǎn)。

表1 癌癥組患者血清中LncRNA ROR、miR-29a表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

隨著高分辨率微陣列和大規(guī)模平行測序技術(shù)的發(fā)展，lncRNA在人類腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。LncRNA ROR最早在誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)中被發(fā)現(xiàn)，在多種生物過程中起調(diào)節(jié)分子的作用。LncRNA ROR在許多類型的癌癥(包括乳腺癌、胰腺癌、肝細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌和鼻咽癌等[11])中表達(dá)失調(diào)。然而，LncRNA ROR在腫瘤中的潛在機(jī)制及其臨床意義仍有待闡明。本研究中，癌癥組患者血清中LncRNA ROR的相對表達(dá)量高于對照組，目前具體機(jī)制尚不清楚。LncRNA ROR基因位于18q21.31，其基因啟動子序列含LINE、SINE和LTR元件，腫瘤發(fā)生時細(xì)胞內(nèi)多能轉(zhuǎn)錄因子如Oct4、Sox2和Nanog結(jié)合LncRNA ROR基因啟動子區(qū)域，促進(jìn)LncRNA ROR表達(dá)[12]。此外，子宮內(nèi)膜癌血清中LncRNA ROR的表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)，Ⅲ～Ⅳ期血清中LncRNA ROR的表達(dá)明顯較高。結(jié)果表明子宮內(nèi)膜癌血清中LncRNA ROR表達(dá)參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。其機(jī)制一方面是LncRNA ROR能夠直接抑制P53蛋白功能，阻斷P53的DNA損傷修復(fù)作用，過度激活下游癌基因，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限增殖，腫瘤分期增高[13]。另一方面，LncRNA ROR可作為內(nèi)源競爭性RNA(ceRNA)抑制miR-205活性，導(dǎo)致miR-205對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因如ZEB1、ZEB2表達(dá)抑制作用減弱，促進(jìn)腫瘤的惡性增殖[14]。

miRNA是一種短的非編碼RNA調(diào)控分子，miRNA基因經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄后形成前體miRNA，在Dicer核糖核酸酶剪切下形成成熟miRNA，參與構(gòu)成RISC后，以堿基互補(bǔ)配對的方式結(jié)合靶基因mRNA的3′UTR，改變靶基因mRNA的穩(wěn)定性調(diào)控基因表達(dá)。研究表明，miR-29a作為一種潛在的腫瘤抑制性miRNA，在喉癌等多種腫瘤中起調(diào)節(jié)作用，miR-29a可通過靶向抑制PROM1基因的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[15]。本研究中，癌癥組患者血清中miR-29a的表達(dá)低于對照組，表明子宮內(nèi)膜癌患者血清中miR-29a表達(dá)下降。其原因與c-myc、核因子-κB對miR-29a基因表達(dá)調(diào)控作用有關(guān)。研究表明，腫瘤發(fā)生時細(xì)胞內(nèi)c-myc、核因子-κB表達(dá)升高，Hedgehog信號通路激活，通過結(jié)合miR-29a基因啟動子區(qū)，抑制miR-29a基因的表達(dá)[16]。本研究中,Ⅲ～Ⅳ期子宮內(nèi)膜癌患者血清中miR-29a表達(dá)明顯較低，表明miR-29a表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)。其原因可能是miR-29a能夠直接結(jié)合并抑制微管成核因子2(TPX2)的表達(dá)，而TPX2表達(dá)具有抑制腫瘤細(xì)胞惡性增殖的能力，miR-29a表達(dá)降低后對TPX2抑制作用減弱，結(jié)果腫瘤細(xì)胞的增殖明顯增強(qiáng)[17]。本研究中子宮內(nèi)膜癌患者血清中LncRNA ROR與miR-29a表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，其原因可能是LncRNA ROR表達(dá)升高后，可作為內(nèi)源競爭性RNA結(jié)合并抑制miR-29a的腫瘤抑制功能，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用[18]，但其二者具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

臨床上腫瘤多為散發(fā)性，尋找無創(chuàng)或微創(chuàng)并且具有較高敏感性和器官特異性的血清診斷標(biāo)志物，有助于子宮內(nèi)膜癌的早期診斷，從而早期治療，對提高患者的生存預(yù)后具有重要意義。本研究進(jìn)一步分析血清LncRNA ROR、miR-29a及兩者聯(lián)合檢測在子宮內(nèi)膜癌中的診斷價值，結(jié)果血清LncRNA ROR、miR-29a聯(lián)合檢測的敏感度、特異度均高于單一指標(biāo)，表明聯(lián)合檢測的診斷效能較高，兩者聯(lián)合檢測診斷的敏感性高于任一單一指標(biāo)，表明聯(lián)合檢測血清LncRNA ROR、miR-29a對于子宮內(nèi)膜癌患者具有較高的診斷價值，可能有助于提高子宮內(nèi)膜癌診斷的準(zhǔn)確性。但由于損傷、感染及免疫等因素均可能影響血清非編碼RNA的水平[19]，并且本研究樣本含量較小，聯(lián)合檢測血清LncRNA ROR、miR-29a對子宮內(nèi)膜癌的診斷價值，尚需大樣本、多中心的隨機(jī)對照試驗深入研究。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌患者血清中LncRNA ROR表達(dá)上調(diào)，而miR-29a表達(dá)下調(diào)，兩者表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)，聯(lián)合檢測血清LncRNA ROR、miR-29a對子宮內(nèi)膜癌具有較高的診斷價值，有望成為新的診斷子宮內(nèi)膜癌的腫瘤標(biāo)志物。