俞 越 石靜萍 祝東林

南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南京 210029

近年來(lái)，自身免疫性腦炎成為神經(jīng)病學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[1]。但目前在對(duì)該病的發(fā)現(xiàn)及認(rèn)識(shí)過(guò)程中出現(xiàn)了過(guò)度診斷的問(wèn)題，而忽略了其與病毒性腦炎的鑒別診斷[2]。由于自身免疫性腦炎強(qiáng)調(diào)早期免疫干預(yù)(如免疫球蛋白、大劑量激素、血漿置換、免疫抑制劑)[3-4]，不加鑒別的診斷泛化極有可能造成上述治療方法的濫用，從而給患者帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)和不可預(yù)料的傷害。因此，探索一種可靠的、快捷的方法對(duì)于自身免疫性腦炎與病毒性腦炎的早期鑒別至關(guān)重要[5]。本文通過(guò)介紹5例患者的診治過(guò)程，探討腦脊液二代基因測(cè)序(next generation sequencing，NGS)在自身免疫性腦炎與病毒性腦炎的早期鑒別診斷中的價(jià)值，為臨床提供借鑒。

1 資料和方法

1.1研究對(duì)象收集2017-05—2019-05在南京腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的5例患者，均經(jīng)腦脊液NGS證實(shí)為病毒性腦炎，其中男3例，女2例；年齡分別為53歲、30歲、49歲、30歲、46歲；腦脊液送檢至NGS報(bào)告時(shí)間分別為1 d、2 d、2 d、2 d、2 d，平均1.8 d。

1.2研究方法所有患者入院后行血清結(jié)締組織病相關(guān)抗體、甲狀腺自身抗體、甲狀腺功能、腦脊液常規(guī)、生化、免疫、細(xì)胞學(xué)、血結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT)、腦電圖、心電圖、胸部CT、頭顱MR平掃+增強(qiáng)或頭顱ASL(動(dòng)脈自選標(biāo)記)等檢查，同時(shí)行自身免疫性腦炎相關(guān)抗體、中樞神經(jīng)脫髓鞘相關(guān)抗體、副腫瘤綜合征相關(guān)抗體檢測(cè)[德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室(杭州)]。同時(shí)留取腦脊液送至華大基因研究院(天津華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所)進(jìn)行NGS檢測(cè)。NGS可以對(duì)樣本中微生物核酸序列進(jìn)行高通量測(cè)序分析，隨后通過(guò)序列比對(duì)(與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有微生物的核酸序列)，從而鑒定出現(xiàn)樣本中存在的微生物。檢測(cè)過(guò)程包括操作及分析，具體檢測(cè)方法參見(jiàn)GUAN等[6-8]報(bào)道。根據(jù)覆蓋度(指檢測(cè)到的該微生物核酸序列長(zhǎng)度占該微生物整個(gè)基因組序列長(zhǎng)度的百分比)、深度(指檢測(cè)到的該微生物堿基總量與檢測(cè)到的該微生物基因組序列長(zhǎng)度的比值，評(píng)價(jià)該測(cè)序量的指標(biāo)之一)、Reads(指所測(cè)微生物的一段核酸序列)、Unique Reads數(shù)(指比對(duì)上該微生物的Reads中，唯一比對(duì)到該微生物基因組序列的Reads條數(shù))并結(jié)合臨床判斷患者的致病微生物。所有患者確診后給予阿昔洛韋抗病毒治療，并根據(jù)患者病情使用小劑量激素(≤200 mg)或大劑量激素沖擊(甲強(qiáng)龍500 mg)治療。所有患者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

2 結(jié)果

2.1前驅(qū)癥狀或前驅(qū)事件5例患者中4例出現(xiàn)前驅(qū)癥狀，且均表現(xiàn)為發(fā)熱頭痛，但無(wú)咽痛流涕、咳嗽咳痰、腹痛腹瀉、尿頻尿急尿痛等其他癥狀。

2.2臨床表現(xiàn)5例患者前驅(qū)癥狀后出現(xiàn)認(rèn)知障礙(如不認(rèn)識(shí)家人、不理解別人文化、外出迷路、反應(yīng)遲鈍、記憶減退、計(jì)算障礙等)，且3例同時(shí)出現(xiàn)精神行為異常(如胡言亂語(yǔ)、打人罵人等)，1例同時(shí)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙(行走不穩(wěn)、一側(cè)肢體輕偏癱)。從前驅(qū)癥狀到臨床表現(xiàn)出現(xiàn)的時(shí)間最長(zhǎng)1個(gè)月，最短2 d。

2.3腦電圖5例患者中3例腦電圖出現(xiàn)中度或中重度異常腦電圖，且均為彌漫分布的慢波節(jié)律，另外2例僅提示輕度異常腦電圖。但腦電圖改變程度與病灶范圍、癥狀輕重不平行，因?yàn)槠渲?例顱內(nèi)多發(fā)病灶，癥狀較重(認(rèn)知障礙+精神行為異常+運(yùn)動(dòng)障礙)，但腦電圖僅提示輕度異常。

2.4頭顱MR表現(xiàn)5例患者中4例出現(xiàn)一側(cè)或兩側(cè)(2例)邊緣系統(tǒng)(顳葉、島葉、額葉)異常信號(hào)，另外1例未發(fā)現(xiàn)明顯異常(患者4)。見(jiàn)圖1。

2.5腰穿腦脊液檢查在入院后第1次腰穿中，白細(xì)胞計(jì)數(shù)最少為29個(gè)/μL(圖1中患者1)，最多為360個(gè)/μL(圖1中患者2)，細(xì)胞分類(lèi)均以淋巴細(xì)胞為主，其他腦脊液檢查，如葡萄糖、氯化物、總蛋白、腦脊液病毒及結(jié)核桿菌核酸檢測(cè)均未見(jiàn)明顯。

2.6血清或腦脊液中自身抗體檢測(cè)所有患者檢測(cè)了自身免疫性腦炎相關(guān)抗體(包括抗NMDA、AMPA1、AMPA2、GABA B、LGI 1、CASPR2抗體)、中樞脫髓鞘疾病相關(guān)抗體(包括抗NMO、MBP、MOG抗體)、副腫瘤綜合征相關(guān)抗體(包括抗Hu、Yo、Ri、CV2、Amphophysin、ANNA-3、Tr、PCA-2、GAD、Ma2、PNMA2抗體)。所有上述抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.7其他檢測(cè)血清結(jié)締組織病相關(guān)抗體、甲狀腺激素及抗體、血結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT)、心電圖、胸部CT、真菌檢測(cè)等均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。

2.8腦脊液NGS共檢出人類(lèi)皰疹病毒Ⅰ型(即單純皰疹病毒)2例，3型(即水痘帶狀皰疹病毒)1例，5型(即人巨細(xì)胞病毒)1例，以及1型、2型及4型(即人EB病毒)混合感染1例，見(jiàn)表1。其中1例患者治療過(guò)程中出現(xiàn)面部縱行帶狀皰疹(圖2)，更加驗(yàn)證了腦脊液NGS的結(jié)果。

圖1 5例患者的頭顱MR(T2相)及腦脊液病理(瑞氏染色，×400)?；颊?：頭顱MR示雙側(cè)額顳葉病灶，腦脊液中白細(xì)胞總數(shù)51個(gè)/μL；患者2：頭顱MR示右顳葉病灶，腦脊液中白細(xì)胞總數(shù)360個(gè)/μL，同時(shí)因患者不配合而出現(xiàn)穿刺損傷，腦脊液中紅細(xì)胞總數(shù)650個(gè)/μL；患者3：頭顱MR示雙側(cè)顳葉病灶，腦脊液中白細(xì)胞總數(shù)29個(gè)/μL；患者4：頭顱MR未見(jiàn)明顯病灶，腦脊液中白細(xì)胞總數(shù)82個(gè)/μL；患者5：頭顱MR示左顳葉病灶，腦脊液中白細(xì)胞總數(shù)85個(gè)/μL

圖2患者4在抗病毒治療過(guò)程中出現(xiàn)的面部縱行帶狀皰疹，進(jìn)一步證實(shí)了該患者腦脊液二代測(cè)序的準(zhǔn)確性

Figure2The facial herpes zoster in patient4during antiviral therapy further confirms the accuracy of second-generation sequencing of cerebrospinal fluid in this patient

表1 5位患者的腦脊液二代測(cè)序結(jié)果

2.9治療及預(yù)后5例患者均給予阿昔洛韋聯(lián)合激素治療，其中 1例(患者1)因癥狀較重給予甲強(qiáng)龍500 mg起始并逐漸減量。療程最短21 d，最長(zhǎng)2個(gè)月。經(jīng)上述治療后，患者發(fā)熱頭痛、認(rèn)知障礙、精神行為異常等均明顯好轉(zhuǎn)而出院，癥狀基本消失。出院后隨訪1個(gè)月，癥狀無(wú)反復(fù)。

3 討論

根據(jù)2016年《Lancet Neurology》公布的自身免疫性腦炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，凡是新近(3個(gè)月以?xún)?nèi))發(fā)生的記憶障礙、精神行為異常、意識(shí)改變或不明原因的癲癇發(fā)作，頭顱MR提示單側(cè)或雙側(cè)顳葉或其他邊緣系統(tǒng)異常信號(hào)、腦脊液提示炎癥改變，均應(yīng)考慮自身免疫性腦炎可能。如發(fā)現(xiàn)相關(guān)抗體陽(yáng)性，則可明確診斷。該標(biāo)準(zhǔn)亦提出“抗體陰性自身免疫性腦炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)”，即只要臨床表現(xiàn)、輔助檢查并排除一些常見(jiàn)的疾病(如感染性疾病、代謝性與中毒性腦病、橋本腦病、腫瘤等)，即便抗體陰性亦可診斷自身免疫性腦炎。因此，本研究中5例患者均在3個(gè)月內(nèi)以精神行為異常、認(rèn)知障礙起病，頭顱MR提示單側(cè)或雙側(cè)邊緣系統(tǒng)異常信號(hào)、腦脊液提示炎癥改變，即便自身免疫性腦炎抗體陰性，仍不能排除自身免疫性腦炎的可能。盡管發(fā)熱可作為感染的證據(jù)之一，但該5例患者并無(wú)其他感染癥狀或證據(jù)，而且發(fā)熱亦是自身免疫性腦炎常見(jiàn)的前驅(qū)癥狀之一。

2017年《中華神經(jīng)科雜志》公布的中國(guó)自身免疫性腦炎診治專(zhuān)家共識(shí)中[10]，對(duì)于診斷“可能的自身免疫性腦炎”及“確診的自身免疫性腦炎”均提出需“合理地排除其他病因”。而感染性疾病尤其是病毒性腦炎是鑒別的重中之重。實(shí)際上，病毒性腦炎仍是目前臨床上最常見(jiàn)的無(wú)菌性腦炎，它的確診依賴(lài)于腦脊液中病原學(xué)檢測(cè)，包括病毒核酸檢測(cè)[11-12]。但由于條件缺乏無(wú)法在所有醫(yī)院開(kāi)展自身免疫性腦炎和副腫瘤相關(guān)抗體檢測(cè)[13]、腦脊液病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性率較低(目前仍主要采用第一代基因檢測(cè))[14-15]、病毒變異快耐藥性增加[16-17]、醫(yī)療界對(duì)新鮮事物的過(guò)分追求等，自身免疫性腦炎的診斷迅猛增加，甚至有泛濫趨勢(shì)，隨之導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)藥物亦出現(xiàn)濫用趨勢(shì)。

NGS又稱(chēng)高通量測(cè)序、深度測(cè)序，源于該技術(shù)可以同時(shí)測(cè)定幾百萬(wàn)甚至上億條DNA或RNA序列，可為臨床節(jié)約大量的時(shí)間成本[18]。同時(shí)，NGS通過(guò)無(wú)偏倚的“全病原體”篩查可快速、精準(zhǔn)地測(cè)定感染病原體。使用NGS對(duì)腦脊液中游離核酸進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)序列比對(duì)，鑒定出樣本中存在的可疑致病微生物。隨著數(shù)據(jù)庫(kù)中微生物序列的迅猛增加，目前NGS可檢測(cè)范圍包括細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體及螺旋體，真菌、DNA病毒和寄生蟲(chóng)等在內(nèi)的2 749種基因組序列已知的微生物[19]。相對(duì)于第一代基因測(cè)序，NGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的診斷方面具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)：NGS可快速發(fā)現(xiàn)感染人體的已知病毒類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)已知病毒的潛在致病力，并發(fā)現(xiàn)可致病的全新病原體，如世界上首次報(bào)道的偽狂犬病毒(即豬皰疹病毒1型)所致人類(lèi)腦炎是通過(guò)NGS鑒定并診斷出來(lái)的[20]。對(duì)于臨床上不典型的、罕見(jiàn)的、治療效果不好的腦膜炎或腦炎病例，運(yùn)用腦脊液NGS有助于早期精準(zhǔn)診斷，或提供早期鑒別診斷依據(jù)[21]。本研究中，自患者腦脊液樣本送到、測(cè)序結(jié)束并完成結(jié)果分析平均耗時(shí)1.8 d，并明確感染病原體，使病情危重、治療效果不好、或無(wú)法明確診斷的患者得到快速而精準(zhǔn)的診斷。更為可觀的是，本研究中除檢測(cè)出臨床上相對(duì)常見(jiàn)的人類(lèi)單純皰疹病毒1型感染，還檢測(cè)出了相對(duì)少見(jiàn)的人類(lèi)皰疹病毒3型(即水痘帶狀皰疹病毒)、4型(即人EB病毒)、5型(即人巨細(xì)胞病毒)，甚至檢測(cè)出迄今未見(jiàn)報(bào)道的單純皰疹病毒1型、2型及EB病毒的混合感染。避免了因長(zhǎng)期診斷不明或治療效果不好而盲目更改診斷(如更改診斷為自身免疫性腦炎)，或改用“大炮轟蚊子”的治療方案(如采用激素沖擊、免疫球蛋白、血漿置換等治療或聯(lián)合治療)，從而避免對(duì)患者造成身心上的傷害和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)，為臨床診治策略提供了極大的幫助及信心。本研究中對(duì)該5例患者從始至終堅(jiān)持使用抗病毒，避免了自身免疫性腦炎治療中常用的丙種球蛋白、免疫抑制劑等免疫修飾治療?；颊呓?jīng)抗病毒治療后獲得良好的轉(zhuǎn)歸，與自身免疫性腦炎的轉(zhuǎn)歸不同，這驗(yàn)證了NGS結(jié)果的可靠性。其中1例患者面部出現(xiàn)的帶狀皰疹進(jìn)一步驗(yàn)證了NGS的準(zhǔn)確性。

值得注意的是，NGS的局限性亦來(lái)源于其高通量的優(yōu)點(diǎn)。腦脊液NGS通常會(huì)獲得多種疑似病原體基因序列[22]，如本研究5例患者腦脊液NGS中均出現(xiàn)覆蓋度相對(duì)較多而深度均為1的痤瘡丙酸桿菌(覆蓋度分別為3.0%～8.6%，平均6.3%)，但通過(guò)查詢(xún)文獻(xiàn)得知該細(xì)菌感染與臨床表現(xiàn)明顯不符[23]，是NGS常見(jiàn)的背景污染菌[24]。該類(lèi)與臨床表現(xiàn)完全不符而出現(xiàn)在NGS結(jié)果分析中的病原體稱(chēng)為背景“噪聲”，而對(duì)這種背景微生物目前尚無(wú)統(tǒng)一的認(rèn)定，這是NGS的局限之一。因此，二代測(cè)序引入臨床初期的目標(biāo)之一，即是找出腦脊液NGS中常見(jiàn)的背景微生物，為NGS以后在臨床的廣泛應(yīng)用提供參考[25]。其次，腦脊液NGS需要根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中已知病原體基因組進(jìn)行比對(duì)而得出結(jié)果。但對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在的或目前未鑒定出來(lái)的病原體基因組，腦脊液NGS則無(wú)法發(fā)現(xiàn)這些病原體，這是NGS的局限之二。因此，腦脊液NGS更加全面的結(jié)果判斷尚需基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的完善。

腦脊液NGS可為臨床上自身免疫性腦炎與病毒性腦炎的鑒別提供快速而精準(zhǔn)的依據(jù)。隨著研究的進(jìn)一步深入，未來(lái)NGS必將突破局限而被廣泛用于各種疾病的早期診斷與治療，從而實(shí)現(xiàn)國(guó)家所提倡的精準(zhǔn)診斷、精準(zhǔn)治療的目標(biāo)。