吳世婷，劉麗芳，熊家青

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007)

銀屑病(psoriasis，PS)是一種慢性炎癥性皮膚病，西醫(yī)俗稱“牛皮癬”，其病程長(zhǎng)、易反復(fù)發(fā)作，皮損表現(xiàn)多為紅斑、鱗屑。中醫(yī)病名最早見(jiàn)于《外科證治全書》：“白疕，一名疕風(fēng)……?！贝送猓倪€述“漸至肢體枯燥坼裂，血出痛楚……”，認(rèn)為本病最基本的病因?yàn)椤把摗保耙驓q金太過(guò)，至深秋燥金用事，乃得此證”，則進(jìn)一步指出本病的發(fā)病是在“血虛”的基礎(chǔ)上“生燥”。而潤(rùn)膚止癢乳正是以養(yǎng)血潤(rùn)燥為原則組方配制而成，臨床上用于治療銀屑病，同時(shí)還取得了不錯(cuò)的療效。在銀屑病的綜合治療中，中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)明顯且效果良好，但其作用機(jī)制尚不完全明確。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化探討潤(rùn)膚止癢乳對(duì)銀屑病皮損中干擾素調(diào)節(jié)因子-4(IRF-4)表達(dá)的影響，以期為中醫(yī)中藥治療銀屑病提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雌性BALB/C小鼠(長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司)，72只，合格證號(hào)：No.43006700013161，許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0011，SPF級(jí)，鼠齡5周，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境許可證號(hào)：SYXK(湘)2015-0003。

1.2 藥物及試劑

咪喹莫特乳膏(湖南科益藥業(yè))；低、高濃度潤(rùn)膚止癢乳(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心配置)；中濃度潤(rùn)膚止癢乳(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心自制)；他扎羅汀乳膏(重慶華邦制藥)；蘇木素-伊紅染液套裝(武漢谷歌生物科技有限公司)；氨水(國(guó)藥集團(tuán))；鹽酸(國(guó)藥集團(tuán))；中性樹膠(國(guó)藥集團(tuán))；HRP山羊抗兔二抗(servicebio，TBS緩沖液(武漢谷歌)。

1.3 儀器及軟件

勻漿儀(康濤科技，型號(hào)：KZ-II)；冰箱(西門子，型號(hào)：BCD-186)；超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰，型號(hào)：SW-CJ-1FD)；病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)：RM2016)；超微量分光光度計(jì)(Thermo，型號(hào)：NanoDrop2000)；正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康，型號(hào)：Eclipse E100)；成像系統(tǒng)(日本尼康，型號(hào)：Nikon DS-U3)；掃描儀(EPSON，型號(hào)：V300)；電子天平(梅特勒-托利多儀器，型號(hào)：PL-203)。

1.4 動(dòng)物造模及標(biāo)本制作

1.4.1 建立動(dòng)物模型 以區(qū)間分組法將72只小鼠隨機(jī)分為6組各12只：正常對(duì)照組，空白模型組，潤(rùn)膚止癢乳高濃度組(0.48 g/mL)、中濃度組(0.24 g/mL)、低濃度組(0.12 g/mL)及他扎羅汀組。硫化鈉脫去小鼠背部約2 cm×2 cm面積毛發(fā)。正常對(duì)照組每日以0.5 mL蒸餾水外涂，其余組小鼠每日以62.5 mg咪喹莫特乳膏外涂8天，造模。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)給藥方法 正常對(duì)照組及空白模型組以每日0.5 mL蒸餾水外涂小鼠背部脫毛區(qū)皮膚，其余組以相應(yīng)藥物外涂。

1.4.3 制作標(biāo)本 以1.4.2方法于藥物作用后的第3天和第8天處死每組小鼠6只，剪取背部皮損。取1/3用福爾馬林固定，剩余于-80 ℃冰箱備用。

1.5 觀察皮損變化

1.5.1 脫毛區(qū)皮損評(píng)價(jià) 觀察每只小鼠的生命體征，拍照記錄脫毛區(qū)皮損的變化、紅斑鱗屑的情況等。

1.5.2 蘇木素-伊紅HE切片染色觀察 以“1.4”中方法取標(biāo)本，固定液固定標(biāo)本24 h，自來(lái)水反復(fù)沖洗，低到高濃度梯度逐級(jí)置于乙醇中脫水，二甲苯浸泡至透明。蠟包裹標(biāo)本。包埋后，制成3 μm切片，脫蠟脫水。蘇木素染色3～5 min，鹽酸及氨分色，沖洗；再用酒精脫水，伊紅染液中染色2～5 min。脫水后中性樹膠封片，顯微鏡下采集圖像及分析圖像。

1.5.3 免疫組化檢測(cè)IRF-4 方法同“1.5.2”，先將石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)緩沖液浸泡，PBS洗滌玻片；50 μL 3%H2O2溶液滅活10 min；小牛血清封閉10～30 min；一抗4 ℃孵育過(guò)夜；再二抗37 ℃孵育50 min；DAB顯色液浸泡至棕黃色；蘇木素復(fù)染1～3 min，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗，氨水反藍(lán)；低到高濃度梯度二甲苯和酒精中浸泡，封片。顯微鏡鏡下觀察進(jìn)行圖像采集和分析。分析累積光密度值(integral optical density mean，IOD)，IOD值越大表明IRF-4表達(dá)越多，越小則反之。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 外觀及HE染色判斷造模成功與否[1-4]

正常對(duì)照組小鼠脫毛區(qū)皮膚正常，未見(jiàn)明顯改變；模型組小鼠的背部脫毛區(qū)皮膚出現(xiàn)紅斑、丘疹、鱗屑，具體見(jiàn)圖1。以“1.4.3”取得的模型組小鼠標(biāo)本，HE染色顯示符合銀屑病皮損改變，具體見(jiàn)圖2。 由以上兩點(diǎn)，說(shuō)明造模成功，可繼續(xù)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 IHC檢測(cè)IRF-4的表達(dá)

造模成功后，分析各組以相應(yīng)藥物作用3天及8天后的IRF-4的IOD值并比較發(fā)現(xiàn)：所有組與空白模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；潤(rùn)膚止癢乳高濃度組、潤(rùn)膚止癢乳低濃度組及他扎羅汀組中IRF-4的表達(dá)高于正常對(duì)照組(P<0.05)，而與潤(rùn)膚止癢乳中濃度組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；潤(rùn)膚止癢乳中濃度組中IRF-4表達(dá)低于潤(rùn)膚止癢乳高及低濃度組(P<0.05)；潤(rùn)膚止癢乳高、中及低濃度組與他扎羅汀組中IRF-4的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。可以得出模型中銀屑病皮損中IRF-4的表達(dá)要高于正常皮膚，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院自制劑、潤(rùn)膚止癢乳治療銀屑病的療效與西藥制劑他扎羅汀療效相當(dāng)，其中潤(rùn)膚止癢乳在臨床常用濃度0.24 g/mL時(shí)療效最優(yōu)，潤(rùn)膚止癢乳治療銀屑病的機(jī)制可能為抑制IRF-4的表達(dá)，且0.24 g/mL濃度對(duì)IRF-4的抑制作用最為明顯。具體數(shù)值見(jiàn)表1，染色情況見(jiàn)圖3、圖4。

第1天 第3天 第5天 第7天

注：除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠皮膚隨藥物作用的天數(shù)及次數(shù)的增加，紅斑、丘疹、鱗屑皮損等皮損增多且明顯。

圖1 小鼠皮膚

組別第3天第8天正常對(duì)照組3218.34±1.4847E3*2737.95±1.3893E3*空白模型組11215.38±3.9498E311466.73±3.5053E3潤(rùn)膚止癢乳低濃度組8927.98±7.2712E3*#▲★6706.71±2.2115E3*#▲★潤(rùn)膚止癢乳中濃度組5023.60±1.9930E3*△★2979.41±1.6610E3*△★潤(rùn)膚止癢乳高濃度組8289.92±1.7537E3*#▲★5111.60±2.4675E3*#▲★他扎羅汀組6959.22±1.0187E3*#△☆4383.71±1.3547E3*#△☆

注：與空白模型組比較，*P<0.05；與正常對(duì)照組比較，#P<0.05，△P>0.05；與潤(rùn)膚止癢乳中濃度組比較，▲P<0.05，☆P>0.05；與他扎羅汀組比較，★P>0.05。

注：①②③為正常對(duì)照組外小鼠藥物作用后3天于光鏡下×40、×100、×200所見(jiàn)，表皮增厚、顆粒層減少，上皮細(xì)胞增生，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；④⑤⑥為正常對(duì)照組外小鼠藥物作用后3天于光鏡下×40、×100、×200所見(jiàn)，表皮增厚、顆粒層消失，角化過(guò)度，上皮細(xì)胞增生，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖2 HE染色

注：A：正常對(duì)照組；B：空白模型組；C：潤(rùn)膚止癢乳高濃度組；D：潤(rùn)膚止癢乳中濃度組；E：潤(rùn)膚止癢乳低濃度組；F：他扎羅汀組

注：A：正常對(duì)照組；B：空白模型組；C：潤(rùn)膚止癢乳高濃度組；D：潤(rùn)膚止癢乳中濃度組；E：潤(rùn)膚止癢乳低濃度組；F：他扎羅汀組

3 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病。在國(guó)內(nèi)外關(guān)于銀屑病的發(fā)生發(fā)展研究和臨床觀察中，認(rèn)為輔助性T細(xì)胞17(h17)及其相關(guān)細(xì)胞因子起著重要作用[1-2]。IRF-4是轉(zhuǎn)錄因子IRF家族中的一員，是由一系列廣泛的有絲分裂刺激所產(chǎn)生的，例如抗原受體參與、脂多糖和CD40信號(hào)[3-4]。同時(shí)也證實(shí)IRF-4是淋巴細(xì)胞、髓細(xì)胞樹狀細(xì)胞分化和成熟過(guò)程中幾個(gè)步驟的關(guān)鍵調(diào)控因子[5]。研究還表明，在銀屑病皮膚皮損中，尤其是角質(zhì)形成細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中，IRF-4表達(dá)明顯升高，故下調(diào)和抑制IRF-4的表達(dá)可能是治療銀屑病和其他自身免疫性疾病的一種方式和新的突破口[6-7]。

中醫(yī)認(rèn)為本病的致病因素多與外感或內(nèi)生風(fēng)、燥、熱、濕、毒等有關(guān)，且認(rèn)為本病的發(fā)病是在患者本已“血虛”的基礎(chǔ)上，加之外感風(fēng)邪，血虛內(nèi)燥不能濡養(yǎng)皮膚而發(fā)病。中醫(yī)名“玄府”即汗孔，是中醫(yī)學(xué)中特有的一種概念。在臨床中，銀屑病患者常常表現(xiàn)為冬季病情加重。夏季病情減輕，究其根本，中醫(yī)認(rèn)為人在冬季，因其氣候寒冷，故人肌膚腠理隨之相對(duì)致密，玄府郁閉而致肌膚無(wú)汗，氣無(wú)法向外流行布散，陰津也就無(wú)法向外布散濡養(yǎng)肌膚毛孔，肌膚失于濡養(yǎng)則干燥脫屑，故病情加重。而夏季氣候溫暖，人肌膚腠理疏松，玄府通利，肌膚得陰津之濡潤(rùn)，故病情較輕。正如《靈樞·五癃津液別》所載：“天暑衣厚則腠理開，故汗出……天寒則腠理閉，氣濕不行?！惫抒y屑病的主要病因病機(jī)為“血虛風(fēng)燥，玄府閉密”[8]。而潤(rùn)膚止癢乳的配方配伍是以中醫(yī)養(yǎng)血潤(rùn)燥法[9]為主，配以生地、當(dāng)歸補(bǔ)血養(yǎng)血，使其皮毛玄府有所濡養(yǎng)；肺主皮毛，調(diào)控玄府，故以何首烏養(yǎng)陰補(bǔ)血以養(yǎng)肺；以桃仁和紅花活血加行氣以通暢玄府；平肌膚之風(fēng)以止癢，故配以地膚子、苦參、蠶砂加上蛇床子燥濕祛風(fēng)；杏仁和瓜蔞霜清熱清熱潤(rùn)腸以滋肺陰；薄荷、冰片清涼發(fā)散，宣發(fā)藥物以止癢。

本研究結(jié)果顯示，潤(rùn)膚止癢乳對(duì)銀屑病的治療與抑制銀屑病皮損中IRF-4的表達(dá)和調(diào)節(jié)免疫有關(guān)，其效果與他扎羅汀相當(dāng)甚至更優(yōu)，且中醫(yī)中藥因其較小的副作用而可更好地應(yīng)用于臨床。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了養(yǎng)血潤(rùn)燥法治療銀屑病的作用及作用機(jī)理，但是中醫(yī)中藥治療銀屑病的作用機(jī)理還需要更多的臨床及實(shí)驗(yàn)研究來(lái)探究。