刁小琴，關(guān)文婷，張 瑛，云 波，黎 亞，關(guān)海寧

（綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061）

肉經(jīng)冷凍處理不僅可以抑制肉中微生物的生長、鈍化酶的活性、減少脂肪及蛋白的氧化[1-2]，而且冷凍肉是各類肉制品生產(chǎn)的主要原料，是國內(nèi)不同地區(qū)間及進出口貿(mào)易和流通的主要形式[3]。冷凍肉在加工和食用前需要經(jīng)過解凍處理，肉在凍結(jié)過程中內(nèi)部會形成大小不一的冰晶，造成細胞膜和組織結(jié)構(gòu)的機械損傷[4]，當(dāng)凍結(jié)肉經(jīng)解凍處理后可能會出現(xiàn)色澤和質(zhì)地發(fā)生變化、質(zhì)量減輕、氣味惡化、蛋白質(zhì)變性等問題[5-7]。因此凍結(jié)與解凍方式的選擇對肉的品質(zhì)起著非常重要的作用。高澤磊等[8]報道，液氮快速冷凍能有效提高魚肉的品質(zhì)。TOLGA D等[9]研究發(fā)現(xiàn)，微波解凍處理的沙丁魚、鳳尾魚及海鯛魚的魚肉色澤變化較大。肌原纖維蛋白是豬肌肉的重要組成成分之一，約占豬肌肉總蛋白的55%，它不僅賦予肉制品特有的風(fēng)味、營養(yǎng)和口感，還具有持水性、乳化性以及凝膠性等多重功能特性，決定產(chǎn)品的最終品質(zhì)[10]，凍藏過程中蛋白的變性，主要是肌原纖維蛋白發(fā)生變性，進而使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性降低[11]。夏秀芳等[12]研究發(fā)現(xiàn)，低溫凍藏會引起肌原纖維特性發(fā)生明顯變化。THANONKAEW A等[13]研究發(fā)現(xiàn)，-18 ℃凍結(jié)的烏賊肉糜，其肌球蛋白發(fā)生變性，進而使蛋白質(zhì)的保水性明顯降低。LIAN P等[14]研究發(fā)現(xiàn)，鰭魚在-20 ℃條件下凍藏4周后，其肌原纖維蛋白的鹽溶性下降。LEYGONIE C等[15]研究認為，冷凍引起的蛋白變性會導(dǎo)致凍結(jié)期間肌肉組織細胞內(nèi)的水分發(fā)生遷移。李銀等[16]采用低溫高濕變溫解凍工藝能夠減弱牛肉解凍過程中肌原纖維蛋白的氧化程度。張春輝等[17]采用低溫高濕變溫解凍羊肉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊肉解凍后其肌肉蛋白表面疏水性降低。

本研究將豬肉采用-18 ℃和-50 ℃凍結(jié)，然后分別以微波、空氣以及4 ℃解凍方式對其進行解凍，測定不同凍結(jié)與解凍方式對豬肉肌原纖維蛋白溶解性、表面疏水性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響，并探討肌原纖維蛋白在-18 ℃和-50 ℃凍結(jié)，不同解凍方式條件下各理化特性指標(biāo)之間的相關(guān)性，以期獲得維持豬肉較好品質(zhì)的凍結(jié)和解凍方式，為實際肉品的凍結(jié)和解凍提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

試驗用材料為豬背最長肌，購自綏化市大潤發(fā)超市，購買后快速運回實驗室，剔除豬肉表面脂肪和結(jié)締組織，切分為80 g 左右的肉塊，進行冷凍處理；大豆色拉油：黑龍江九三油脂有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）：北京索萊寶科技有限公司；乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA）：北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）：上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：上海源葉生物有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銅、氯化鎂、氯化鈉（均為分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TH-120-150-WA超低溫冰箱：北京天地精儀科技有限公司；EG720KG4-NA美的微波爐：美的微波爐制造有限公司；GL-16G-Ⅱ高速冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；DS-1高速組織搗碎機：上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；752紫外-可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；T18 basic型勻漿機：德國IKA公司；F96S熒光分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；TP3001探針式電子溫度計：義烏市宏輝電子技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 凍結(jié)方法

切分好的肉塊隨機分成兩組，每組3塊，分別置于-18 ℃和-50 ℃的條件下凍結(jié)，凍藏3 d后進行解凍處理；新鮮肉樣為對照組，不做凍結(jié)及解凍處理。

1.3.2 解凍方法

-18 ℃和-50 ℃的條件下凍結(jié)組分別采用微波解凍、空氣解凍（室溫20 ℃）和4 ℃解凍。

（1）微波解凍：將凍結(jié)肉樣放入潔凈的塑料托盤中，置于微波爐中，啟動“質(zhì)量解凍”按鈕（微波功率400 W、頻率2 450 MHz），解凍到肉塊中心溫度達到4 ℃即可。

（2）空氣解凍：將凍結(jié)肉樣放入潔凈的塑料托盤中，以空氣為介質(zhì)進行自然解凍，采用探針式電子溫度計測定肉塊中心溫度達到4 ℃即可。

（3）4 ℃解凍：將凍結(jié)肉樣放入潔凈的塑料托盤中，置于4 ℃冰箱進行解凍，肉塊中心溫度達到4 ℃即可。

1.3.3 肌原纖維蛋白的提取

參照XIA X F等[18]的方法從不同處理組中提取肌原纖維蛋白，以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用雙縮脲法測定蛋白濃度，得牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.236 4x+0.014 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 9，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算各處理組的肌原纖維蛋白含量[19]。

1.3.4 溶解性的測定

將不同處理的肌原纖維蛋白用50 mmol/L pH 6.2的磷酸鹽緩沖液（含有0.6 mol/L NaCl）配制成10 mg/mL的溶液于離心管中，4 000 r/min離心40 min后，上清液用雙縮脲法測定其吸光度值，依上述標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算蛋白含量，按下式計算溶解度：

1.3.5 表面疏水性的測定

蛋白質(zhì)的表面疏水性反映蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸的相對含量，進而可以衡量蛋白質(zhì)的變性程度[20]，通常表面疏水性與變性程度呈正相關(guān)。根據(jù)KATO A等[21]的方法，以ANS為熒光探針，利用熒光分光光度計測定不同處理肉樣蛋白質(zhì)的表面疏水性。蛋白質(zhì)量濃度被稀釋在5～500 μg/mL之間，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別設(shè)置為365 nm和484 nm。以熒光強度（y）為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，所得曲線的斜率即為表面疏水性指數(shù)。

1.3.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

參照RAMIREZ-SUAREZ J C等[22]的方法略作改動，取8 mL 0.1%的不同處理的肌原纖維蛋白樣品溶液分別加入2 mL大豆色拉油，高速分散器8 000 r/min攪打1 min后，立即于容器底部取樣50 μL，加入到5 mL 0.1%的SDS溶液中，漩渦振蕩混勻后在波長500 nm處測定吸光度值，以SDS溶液作為空白。室溫放置10 min后再次取樣測定。乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsion stability index，ESI）分別按下式計算：

式中：EAI為乳化活性指數(shù)，m2/g；ESI為乳化穩(wěn)定性指數(shù)；F為稀釋倍數(shù)；Φ為乳化液中油相的比例；C為蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度，g/mL；A0為初始乳狀液的吸光度值；A10為10 min后乳狀液的吸光度值。

1.3.7 起泡性和起泡穩(wěn)定性的測定

將不同處理的肌原纖維蛋白配制成5 mg/mL的溶液，分別取10 mL溶液（V）均質(zhì)2 min（10 000 r/min），迅速倒入50 mL的量筒中，讀取泡沫體積（V0），靜置30 min后，再次讀取泡沫體積（V30）。起泡性和起泡穩(wěn)定性計算公式如下：

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，計算結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 2010作圖，差異顯著性分析采用Statistix 8.0軟件進行，相關(guān)性分析采用SPSS軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同解凍方式對肉品中肌原纖維蛋白含量的影響

不同解凍方式對肉品中肌原纖維蛋白含量的影響結(jié)果見圖1。

圖1 不同解凍方式對肌原纖維蛋白含量的影響Fig.1 Effect of different thawing methods on content of myofibril protein

由圖1可知，經(jīng)不同凍結(jié)和解凍處理的豬肉肌原纖維蛋白含量均較對照組降低，但不論是那種凍結(jié)方式，采用4 ℃解凍方式得到的肌原纖維蛋白含量與對照組差異不顯著（P＞0.05），而采用微波解凍，-18 ℃和-50 ℃凍結(jié)的肌原纖維蛋白含量分別較對照組顯著降低30.3%和26.6%（P＜0.05），這可能是由于微波解凍過程中，熱量迅速傳遞致使蛋白質(zhì)大量變性，同時在解凍過程中，較高的溫度導(dǎo)致不飽和脂肪酸氧化生成自由基，進而與蛋白質(zhì)相結(jié)合，引起蛋白含量降低[23-24]。從圖1還可以看出，采用微波解凍、空氣解凍和4 ℃解凍，-50 ℃凍結(jié)的肌原纖維蛋白含量（4.84%、5.25%、6.32%）分別高于-18 ℃凍結(jié)的肌原纖維蛋白含量（4.60%、5.16%和6.07%），這可能是在較低的凍結(jié)溫度下形成的冰晶對細胞結(jié)構(gòu)破壞小，蛋白在解凍時保留率高。

2.2 不同解凍方式對肉品中肌原纖維蛋白溶解度的影響

不同解凍方式對肉品蛋白質(zhì)溶解度的影響結(jié)果見圖2。

由圖2可知，凍結(jié)與解凍過程會使蛋白質(zhì)的溶解度降低，這可能是由于豬肉在凍結(jié)與解凍過程中肌纖維收縮，蛋白質(zhì)的去折疊與變性程度提高，因而導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)的溶解性降低[25]。BADII F等[26]在-10 ℃和-30 ℃環(huán)境下貯藏大西洋鱈魚和黑線鱈魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種魚的蛋白溶解性均隨著貯藏時間的延長而降低，并且貯藏溫度越高，溶解性損失越嚴重。本研究也發(fā)現(xiàn)，采用微波解凍、空氣解凍和4 ℃解凍，-50 ℃凍結(jié)的豬肉肌原纖維蛋白溶解度（16%、19.6%和22.05%）均高于-18 ℃凍結(jié)的豬肉（14.75%、17.9%和19.65%），可能是較低的凍結(jié)溫度形成的冰晶小，對肌纖維的傷害較小。采用-50 ℃凍結(jié)、4 ℃解凍方式能有效保持蛋白的溶解性，而微波解凍與空氣解凍由于較高的溫度可能導(dǎo)致蛋白變性，從而使其溶解度分別較4 ℃解凍降低27.4%和11.1%。

圖2 不同解凍方式對肌原纖維蛋白溶解度的影響Fig.2 Effect of different thawing methods on solubleness of protein

2.3 不同解凍方式對肉品中肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

不同解凍方式對肉品蛋白質(zhì)表面疏水性的影響結(jié)果見圖3。

圖3 不同解凍方式對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.3 Effect of different thawing methods on surface hydrophobicity of protein

由圖3可知，豬肉肌原纖維蛋白經(jīng)冷凍解凍處理后，除了采用-50 ℃凍結(jié)4 ℃解凍的處理組其疏水性指數(shù)（2 025）與未經(jīng)處理的對照組（1 890）差異不顯著（P＞0.05）外，其余處理均顯著增加（P＜0.05），說明凍結(jié)與解凍處理使肌原纖維蛋白發(fā)生了變性。鄧思楊等[27]研究發(fā)現(xiàn)，鯉魚脊背肉經(jīng)冷凍解凍處理1次后，肌原纖維蛋白表面疏水性增加，MALGORZATA K等[28]在研究凍融處理對太平洋鱈魚天然肌動蛋白的理化性質(zhì)的影響中發(fā)現(xiàn)，凍融循環(huán)后蛋白的表面疏水性也顯著增加，認為可能是肌球蛋白頭部的變化導(dǎo)致疏水性基團的暴露。本研究結(jié)果表明，不論采用哪種解凍方式，-50 ℃凍結(jié)的肌原纖維蛋白其疏水性均低于-18 ℃凍結(jié)的蛋白，但采用空氣解凍，-50 ℃凍結(jié)蛋白的疏水性指數(shù)（2 115.5）和-18 ℃凍結(jié)蛋白的疏水性指數(shù)（2 321.5）差異不顯著（P＞0.05），同時采用4 ℃解凍，-50 ℃凍結(jié)（2 215.5）和-18 ℃凍結(jié)（2 101）差異也不顯著（P＞0.05），而采用微波解凍的蛋白，-50 ℃凍結(jié)（2 415）和-18 ℃凍結(jié)（2 720）差異顯著（P＜0.05）?？赡苁俏⒉訜崴俾瘦^快，破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)部的基團被暴露，使表面疏水性增加。

2.4 不同解凍方式對肉品中肌原纖維蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

不同解凍方式對肉品蛋白質(zhì)乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響結(jié)果見圖4。

圖4 不同解凍方式對肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of different thawing methods on emulsion activity and emulsion stability of protein

由圖4可知，豬肉經(jīng)冷凍和解凍處理后，肌原纖維蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性均較對照組降低，這可能是由于肉在冷凍和解凍過程中蛋白質(zhì)變性，不溶性蛋白質(zhì)增多，乳化特性下降，但-18 ℃與-50 ℃凍結(jié)、4 ℃解凍處理組和-50 ℃凍結(jié)、空氣解凍處理組，其乳化活性（7.63 m2/g、7.89 m2/g、7.51 m2/g）均與對照組（8.19 m2/g）差異不顯著（P＞0.05），-50 ℃凍結(jié)、4 ℃解凍處理組的乳化穩(wěn)定性（32%）與對照組（37.1%）差異也不顯著（P＞0.05）。采用-18 ℃與-50 ℃凍結(jié)，微波解凍處理組的乳化性（6.84、7.16 m2/g）和乳化穩(wěn)定性（23.9%、26.6%）分別與對照組相比，均顯著下降（P＜0.05），可能是微波解凍易加速蛋白質(zhì)氧化，進而蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性被破壞，蛋白質(zhì)的交聯(lián)能力降低，從而造成蛋白質(zhì)乳化活性和乳化穩(wěn)定性下降。李學(xué)鵬等[29]報道凍藏會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生氧化和變性，破壞蛋白結(jié)構(gòu)的完整性，使其無法形成穩(wěn)定的界面膜，進而使蛋白與脂肪的交聯(lián)能力下降，蛋白的乳化性降低。

2.5 不同解凍方式對肉品中肌原纖維蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響

不同解凍方式對肉品蛋白質(zhì)起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響結(jié)果見圖5。

圖5 不同解凍方式對肌原纖維蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of different thawing methods on foaming activity and stability of protein

由圖5可知，與對照組相比較，冷凍與解凍處理均使肌原纖維蛋白的起泡性降低。其中-18 ℃凍結(jié)、微波解凍處理組起泡性（20.70%）與對照組（34.25%）相比，下降最為顯著（P＜0.05），起泡穩(wěn)定性也表現(xiàn)出相同的趨勢，這可能是微波解凍處理產(chǎn)生的較高熱量增強了蛋白質(zhì)的變性程度。丁一等[30]研究發(fā)現(xiàn)，隨著冷凍時間的延長，肌原纖維蛋白變性程度加大，蛋白的起泡性降低。

2.6 不同解凍方式條件下各理化特性指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

肌原纖維蛋白在-18 ℃和-50 ℃凍結(jié)不同解凍方式條件下各理化特性指標(biāo)之間的相關(guān)性分析，結(jié)果見表1和表2。

表1 -18 ℃凍結(jié)不同解凍方式條件下肌原纖維蛋白各指標(biāo)相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of various parameters of myofibrillar protein obtained at -18 ℃frozen and different thawing methods

由表1和表2可知，-18 ℃和-50 ℃凍結(jié)的蛋白其乳化穩(wěn)定性分別與乳化性、起泡性與起泡穩(wěn)定性間有顯著相關(guān)性（P＜0.05），溶解性與乳化性與起泡性、起泡穩(wěn)定性間呈極顯著相關(guān)性（P＜0.01），表面疏水性均與其他指標(biāo)呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），而其他指標(biāo)之間呈正相關(guān)，這說明在不同的冷凍和解凍條件下，肌原纖維蛋白各指標(biāo)之間的變化是相互關(guān)聯(lián)。

表2 -50 ℃凍結(jié)不同解凍方式條件下肌原纖維蛋白各指標(biāo)相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of various parameters of myofibrillar protein obtained at -50 ℃frozen and different thawing methods

3 結(jié)論

在不同凍結(jié)與解凍方式下肌原纖維蛋白的含量及理化特性均發(fā)生了變化，表現(xiàn)出溶解性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性、起泡性及起泡穩(wěn)定性降低，表面疏水性增加，采用-18 ℃凍結(jié)，微波解凍的肌原纖維蛋白與未經(jīng)處理的對照組相比，各理化指標(biāo)下降最為明顯，而采用-50 ℃凍結(jié)，4 ℃解凍的肌原纖維蛋白其含量與理化特性均保持較高，其機理有待進一步深入研究。