孫金沅，王 松，陳 璐，周慶伍，李安軍，李賀賀，孫寶國*

（1.北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048；2.北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點實驗室，北京 100048；3.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州 236000）

白酒是中國人民生活中必不可少的酒精飲料。隨著社會的發(fā)展，人們生活水平的提高，人們對白酒的要求也不單單是喝著好喝，同時希望能夠喝的健康。白酒作為中國的國酒，風(fēng)味與健康雙導(dǎo)向已經(jīng)成為白酒發(fā)展的新趨勢[1]，針對白酒中生物活性成分的研究也越來越引起研究人員的重視[2-6]。安徽古井貢酒是濃香型白酒的典型代表，被稱為中國八大名酒之一，很多研究表明，其微量成分含量豐富[7-8]。同時，李安軍等[9]采用頂空固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（two comprehensive dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometer，GC×GC-TOF/MS）在古井貢酒中鑒定出吡嗪類、萜烯類、內(nèi)酯類以及含不飽和鍵的烯烴、有機酸、酯類等健康成分。

酒體中的微量成分來源于復(fù)雜的原料體系、微生物自然發(fā)酵代謝體系、貯存體系[10]。釀酒原料與酒曲混合后通過微生物發(fā)酵形成酒醅，酒醅中富集了豐富的香氣成分和生物活性成分，是酒體中微量成分的直接來源。但是對酒醅中揮發(fā)性成分的研究，更多地集中于對風(fēng)味物質(zhì)的分析[11-13]，如宮俐莉等[14-15]采用溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)法（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）和頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）確定了古井貢酒醅中重要的香氣化合物，而對于酒醅中揮發(fā)性生物活性成分的研究較少。

本實驗中，采用SAFE法結(jié)合GC-MS對古井貢酒入池醅和出池醅中揮發(fā)性成分進(jìn)行提取分析，并采用外標(biāo)法對其中經(jīng)文獻(xiàn)報道具有生物活性的化合物進(jìn)行定量。探索不同的化合物在入池和出池醅中含量的變化，同時結(jié)合主成分分析，比較不同酒醅的差異性和相關(guān)性，為古井酒醅的分析提供更豐富的數(shù)據(jù)支持，也為探究古井貢酒中揮發(fā)性生物活性成分的來源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣品：安徽古井貢酒酒廠；入池酒醅：混合進(jìn)窖前酒醅；出池酒醅：出池待蒸酒酒醅，根據(jù)產(chǎn)原酒質(zhì)量不同，分為上中下三層按照五點取樣法進(jìn)行取樣。

二氯甲烷（分析純，重蒸處理）、無水乙醇（色譜純）、無水硫酸鈉（分析純，烘干備用）、氯化鈉（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷（色譜純）、C6～C30的正構(gòu)烷烴（色譜純）：北京伊諾凱科技有限公司；2-戊酮、檸檬烯、3-甲基-3-丁烯-1-醇、3-羥基-2-丁酮、羥基丙酮、2-乙酰基呋喃、3-甲硫基丙醇、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、香蘭素、香草乙酮、DL-泛酰內(nèi)酯、2-正戊基呋喃、壬醛、3-糠醛、四甲基吡嗪、苯甲醛、γ-丁內(nèi)酯、苯乙醛、苯乙酮、糠醇、3-甲基-2（5H）呋喃酮、愈創(chuàng)木酚（均為色譜純）：百靈威科技有限公司；正己酸乙酯、庚酸乙酯、4-乙基苯酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、2-乙?；量ň鶠樯V純）：美國Accustandard公司；苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、2,4-二叔丁基苯酚（均為色譜純）：德國Dr.Ehrenstorfer 公司；δ-己內(nèi)酯、月桂酸乙酯、4-甲基苯酚、N-甲基-2-吡咯甲醛、γ-戊內(nèi)酯、γ-己內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯（均為色譜純）：日本東京化成工業(yè)株式會社。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent GC 7890-5975 MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；FFAP毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美國Supelco 公司；溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)裝置（定制加工）：莘縣京興玻璃器皿有限公司；XDS5復(fù)合分子渦輪泵：英國Edwards公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；干浴氮吹儀：美國Organomation Associates公司；BL-2200H電子分析天平：島津國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SAFE法對酒醅中揮發(fā)性成分分析

準(zhǔn)確稱取酒醅樣品30 g，粉碎后裝入圓底燒瓶，加入100 mL重蒸二氯甲烷，于20 ℃恒溫水浴中攪拌萃取2 h，得澄清黃色萃取液。

SAFE裝置循環(huán)水浴及恒溫水槽均設(shè)置溫度為25 ℃，系統(tǒng)的真空度達(dá)到1×10-4MPa時開始緩慢滴加萃取液。待收集瓶中提取液自然融化后加入10 g活化的無水硫酸鈉于4 ℃冰箱中靜置12 h，過濾、收集提取液采用精餾濃縮至5 mL后進(jìn)行氮吹，最終濃縮至0.5 mL備用。所有實驗重復(fù)3次。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜（GC）條件：采用FFAP毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.25 μm）；載氣為氦氣（He），流速為1 mL/min；色譜柱升溫程序為：起始柱溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至100 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至150 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比5∶1，進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜（MS）條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描模式全掃描，質(zhì)量掃描范圍45～450 m/z，調(diào)諧文件為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧。

1.3.3 揮發(fā)性成分的定性分析

數(shù)據(jù)處理由GC-MSD化學(xué)工作站完成。

1.3.4 揮發(fā)性成分的定量分析

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：取一定量標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜級二氯甲烷配成單標(biāo)，混合成混標(biāo)，將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成7個梯度備用。采用外標(biāo)法，以待定量物質(zhì)的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以待定量物質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算酒醅生物活性成分的含量。上述均進(jìn)行3次平行實驗。

方法驗證：線性、檢出限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantitation，LOQ）、精密度。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程以線性相關(guān)系數(shù)（R2）進(jìn)行評估；檢出限為定量化合物色譜峰信噪比（S/N）等于3對應(yīng)的質(zhì)量濃度；定量限為定量化合物色譜峰信噪比（S/N）等于10對應(yīng)的質(zhì)量濃度。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件對化合物的定量結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）和T檢驗，結(jié)果表示為平均±標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，SD），不同的字母代表含量存在顯著差異，P＜0.05；并采用SPSS 22.0軟件對4種酒醅中生物活性成分的定量結(jié)果進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性結(jié)果

采用SAFE法結(jié)合GC-MS對4種酒醅進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 不同酒醅樣品中化合物數(shù)量對比Fig.1 Comparison of the number of compounds in different Jiupei samples

圖2 4種酒醅揮發(fā)性化合物相對含量比較Fig.2 Comparison of relative contents of volatile compounds in 4 kinds of Jiupei

由圖1和圖2可知，通過SAFE法結(jié)合GC-MS分析，在4種酒醅中共定性出171種揮發(fā)性化合物，入池醅中定性出129種，上、中、下出池醅中各定性出132種、133種和150種。在酒醅中檢測出的酯類化合物最多，均＞50種，下層醅中酯類種類最多（65種），相對含量分別為16.5%、68.6%、69.9%和51.7%；對于酸類化合物而言，入池醅中種類最少，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在產(chǎn)酸細(xì)菌的作用下，酒醅中酸類物質(zhì)增加[16]，因而在出池醅中，酸類化合物種類和含量均明顯增加，其中下層醅最高為35.4%。

本實驗根據(jù)定性結(jié)果，選擇其中39種文獻(xiàn)報道認(rèn)為具有生物活性的化合物進(jìn)行定量分析，這些化合物被認(rèn)為是可以緩解酒精傷害，調(diào)節(jié)生理節(jié)奏，以及預(yù)防疾病和促進(jìn)康復(fù)等[10]，是對人體有益的功能性成分[1，6，10]。

2.2 定量結(jié)果

不同酒醅中化合物的線性方程、線性范圍、檢出限、定量限結(jié)果見表1，采用外標(biāo)法對39種生物活性成分進(jìn)行定量，具體結(jié)果見表2。

在所定量的化合物中，包括酚類（9種）、醛酮類（9種）、內(nèi)酯類（6種）、呋喃類（5種）、酯類（5種）、醇類（2種）、含氮類（四甲基吡嗪、2-乙?；量⑤葡╊悾幟氏?；所定量化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）＜10%。

表1 不同酒醅樣品中生物活性成分的定量結(jié)果Table 1 Quantitative results of bioactive components in different Jiupei samples

續(xù)表

表2 不同酒醅樣品中生物活性成分含量檢測結(jié)果Table 2 Determination results of bioactive components contents in different Jiupei samples μg/g

續(xù)表 μg/g

白酒中低分子有機酸及其酯對人體有益，如乙酸、丁酸、乳酸及其酯類[1]。本研究中，乙酸和丁酸在出池醅中含量高于入池醅，乳酸只在3種出池酒醅檢測到。TOMOO K等[17]研究表明，乙酸可促進(jìn)飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟脂氧化基因表達(dá)，抑制體內(nèi)脂肪積累；丁酸可以提高腸道免疫力，預(yù)防結(jié)腸的癌變[18]；乳酸可維持菌群生態(tài)平衡、促消化、增強免疫[19]。白酒中的中鏈脂肪酸酯（如辛酸乙酯、癸酸乙酯等）和高級脂肪酸酯（如棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞麻酸乙酯等），在人體中會水解成相應(yīng)的脂肪酸，對人體具有積極作用，如辛酸、癸酸等中鏈脂肪酸可以降低高甘油三酯水平，調(diào)節(jié)膽固醇代謝[20]；亞麻酸等高級脂肪酸具有降血壓、抗氧化、抗癌等功效[21]。在定量的3種高級脂肪酸酯中，月桂酸乙酯在入池醅（0.412±0.011 8）μg/g中含量高于出池醅；而棕櫚酸乙酯和油酸乙酯在下層醅中含量最高，分別為（2.777±0.094 0）μg/g、（2.035±0.084 1）μg/g。

內(nèi)酯類化合物是白酒中一類重要的風(fēng)味化合物[22-23]，多數(shù)內(nèi)酯類物質(zhì)也是對人體健康有益的功能性成分[24]，趙東瑞等[23，25]在古井貢酒中發(fā)現(xiàn)多種內(nèi)酯類化合物。本實驗中對酒醅中6種內(nèi)酯類化合物進(jìn)行定量，并對同一種化合物在不同酒醅中含量進(jìn)行顯著性分析，其相對入池酒醅中含量變化如圖3所示。由圖3可知，在出池醅中，6種化合物含量均顯著增加。其中5種化合物在下層醅中含量顯著高于上層和中層，而γ-丁內(nèi)酯在中層醅的含量[（6.289±0.359 5）μg/g]顯著高于下層[（5.305±0.174 1）μg/g]和上層醅[（5.261±0.260 0）μg/g]，同時γ-丁內(nèi)酯也是4種醅中含量最高的內(nèi)酯化合物。

圖3 不同酒醅樣品中內(nèi)酯類化合物含量檢測結(jié)果Fig.3 Determination results of lactones compounds content in different Jiupei samples

醛酮類是酒醅中一類功能性前體物質(zhì)，經(jīng)過微生物的代謝過程可轉(zhuǎn)化為其他對人體有益的功能性成分，如3-羥基-2-丁酮可作為四甲基吡嗪的前體物質(zhì)，與氨基酸轉(zhuǎn)化而來的氨經(jīng)非酶促反應(yīng)生成四甲基吡嗪[26]。酒中揮發(fā)性醛類物質(zhì)在人體中與酒石酸作用，可提高血液的緩沖性，促進(jìn)新陳代謝的速率[27]。焦向英等[28]研究發(fā)現(xiàn)香草乙酮對再灌注大鼠心肌具有保護(hù)作用。本研究定量的9種醛酮類化合物中，壬醛、苯甲醛、苯乙醛、苯乙酮在出池醅中含量均高于入池醅，2-戊酮和香草乙酮僅在下層醅中含量高于入池醅。3-羥基-2-丁酮和羥基丙酮在入池醅中含量更高，說明這兩種化合物在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化為其他化合物。N-甲基-2-吡咯甲醛在入池醅中未檢出，可能是在酒醅發(fā)酵過程中產(chǎn)生。此外，呋喃環(huán)是最簡單的含氧五元雜環(huán)，呋喃雜環(huán)結(jié)構(gòu)具有很強的藥理學(xué)活性，在各類藥物中都能發(fā)揮重要作用[29]。酒醅中5種呋喃類化合物經(jīng)發(fā)酵后含量均有所增加，其中，糠醇含量最高，2-正戊基呋喃含量最低。

酒醅中的酚類化合物，大多是釀酒原料中單寧、木質(zhì)素等的分解物經(jīng)發(fā)酵過程中微生物代謝生成[30]。據(jù)報道，酚類物質(zhì)是良好的自由基清除劑，具有抗氧化、抗腫瘤的作用，可阻斷致癌物的形成和抑制其在機體內(nèi)的代謝和轉(zhuǎn)化，進(jìn)而提高機體免疫力[31-32]。本研究定量了9種酚類物質(zhì)，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、2,4-二叔丁基苯酚和香蘭素在出池醅中含量低于入池醅，由此推測，他們在發(fā)酵過程中可能轉(zhuǎn)化為其他化合物；4-甲基苯酚在下層醅中含量[（2.485±0.0782）μg/g]高于上層[（0.370±0.020 0）μg/g]和中層醅[（0.427±0.021 5）μg/g]，也有研究者發(fā)現(xiàn)4-甲基苯酚在酒醅中的增長主要發(fā)生在底層酒醅中[33]；剩余5種酚類化合物經(jīng)發(fā)酵后含量增加，除4-乙基愈創(chuàng)木酚外，含量均為下層醅＞中層醅＞上層醅＞入池醅。

4-甲基愈創(chuàng)木酚（4-methylguaiacol，4-MG）和4-乙基愈創(chuàng)木酚（4-ethylguaiacol,4-EG）是阿魏酸經(jīng)過微生物降解后的產(chǎn)物，清除自由基的有效能力已通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS），氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）和還原力測定驗證[34]，并且4-MG和4-EG具有保護(hù)HepG2細(xì)胞免受偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2'-azobis-2-methyl-propanimidamide,dihydrochloride，AAPH）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的能力[35]。

圖4 不同酒醅樣品中4-MG和4-EG含量變化Fig.4 Changes of 4-MG and 4-EG contents in different Jiupei samples

由圖4可以看出，入池醅中4-EG含量略高于4-MG，無顯著性差異（P＞0.05），但是在出池醅中4-MG含量均高于4-EG，且在中層和下層醅中4-MG的含量均顯著高于4-EG（P＜0.05），說明在酒醅發(fā)酵過程中，4-MG的含量變化更大。

此外，檸檬烯具有抗癌、抗炎癥等作用[36]，可抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[37]；吡嗪類化合物是白酒中重要的健康因子，四甲基吡嗪具有調(diào)節(jié)心臟收縮功能、抗氧化、保護(hù)大腦和修復(fù)脊髓損傷等作用[38]；孫惜時等[39]研究發(fā)現(xiàn)，3-甲硫基丙醇有一定的抗氧化和分解甘油三酯的能力。這3種物質(zhì)的定量結(jié)果表明，檸檬烯只在上層和中層醅的含量高于入池醅；四甲基吡嗪和3-甲硫基丙醇經(jīng)發(fā)酵后含量均增加，并且在下層醅中含量最高。

2.3 4種酒醅中生物活性成分的主成分分析

采用SPSS軟件，對4種酒醅樣品中39種生物活性成分的定量結(jié)果進(jìn)行主成分分析（PCA），得到主成分的特征值和貢獻(xiàn)率見表3，主成分載荷矩陣及特征向量見表4。4種酒醅的主成分散點圖見圖5，39種生物活性物質(zhì)主成分載荷圖見圖6。

表3 主成分的特征值和貢獻(xiàn)率Table 3 Eigen values contribution rate of principal components

由表3可知，前3個主成分累計方差貢獻(xiàn)率達(dá)到100%，而第一和第二主成分累計貢獻(xiàn)率為93.850%，足以說明酒醅樣品中生物活性成分的數(shù)據(jù)規(guī)律。

表4 主成分載荷矩陣及特征向量Table 4 Loading matrix and eigenvector of principal components

續(xù)表

由表4可知，第一主成分反映的指標(biāo)主要有2-戊酮、油酸乙酯、香草乙酮、庚酸乙酯、正己酸乙酯、苯酚、壬醛、δ-己內(nèi)酯、4-甲基苯酚、棕櫚酸乙酯；第二主成分反映的指標(biāo)主要有4-乙基愈創(chuàng)木酚、N-甲基-2-吡咯甲醛、苯乙酮、苯乙醛、γ-丁內(nèi)酯、4-甲基愈創(chuàng)木酚、羥基丙酮、月桂酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、2,4-二叔丁基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香蘭素，主要指向酚類和醛酮類。

圖5 4種酒醅樣品的主成分散點圖Fig.5 Principle components scatter diagram for 4 kinds of Jiupei samples

圖6 39種生物活性物質(zhì)主成分載荷圖Fig.6 Principle components loading diagram for 39 bioactive components

由圖5、圖6可知，下層醅分布在第一象限，與第一、二主成分呈正相關(guān)，與之關(guān)系密切的化合物主要有3-甲硫基丙醇、糠醇、γ-己內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、2-乙酰基呋喃、愈創(chuàng)木酚、γ-壬內(nèi)酯、四甲基吡嗪、4-乙基苯酚；上層醅和中層醅均位于第二象限，且距離較近，說明這兩種酒醅中生物活性物質(zhì)組成相似，與他們關(guān)系密切的化合物主要有苯乙酮、3-糠醛、檸檬烯；入池醅位于第三象限，與入池醅密切相關(guān)的化合物主要有2,4-二叔丁基苯酚、月桂酸乙酯、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香蘭素、3-羥基-2-丁酮、羥基丙酮。

由PCA結(jié)果可知，經(jīng)過酒醅發(fā)酵，入池醅與3種出池醅有較大差異，其中，入池醅與上層和中層醅在第一主成分中表現(xiàn)出相似性，區(qū)別主要表現(xiàn)為在第二主成分上的差異；入池醅與下層醅恰好處于對立象限，說明二者活性成分的差異較大。另外，可能因為在窖池中空間位置不同，造成酒醅發(fā)酵不平衡，處于池底的下層醅由于與窖泥微生物的充分接觸，使得上層和中層醅中活性成分表現(xiàn)出差異性，主要為在第一主成分上的區(qū)分。

3 結(jié)論

本實驗采用溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)法（SAFE法）結(jié)合GC-MS對入池醅和3種不同層出池酒醅中揮發(fā)性成分提取分析，定性出171種化合物。采用外標(biāo)法對酒醅中39種文獻(xiàn)報道具有生物活性的物質(zhì)進(jìn)行定量，有29種化合物經(jīng)過發(fā)酵后含量增加；在3種出池醅（上層、中層、下層）中的總含量分別為（25.65±1.188）μg/g、（30.87±1.59）μg/g、（90.14±2.63）μg/g，結(jié)果顯示下層醅中總含量最高。

采用主成分分析法對不同酒醅中生物活性成分的定量結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：不同酒醅樣品之間具有不同的差異性，入池醅與下層醅處于對立象限，二者差異較大；而下層醅與中層、上層醅的差異主要體現(xiàn)在第一主成分上，這種差異可能是由于窖池中不同空間位置發(fā)酵不平衡而造成的，還需做進(jìn)一步的分析研究。

對入池和出池醅中生物活性成分的分析，對于量化酒醅之間的差異提供基礎(chǔ)，也為企業(yè)進(jìn)行酒醅品質(zhì)的鑒定和評價提供數(shù)據(jù)支持，推進(jìn)企業(yè)以風(fēng)味和健康雙導(dǎo)向的大力發(fā)展。