顏飛翔，董佳萍，陳 龍，李思萱，任潔萍，朱 丹，牛廣財*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學 生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

北五味子（Schisandra chinensis）是木蘭科植物五味子的成熟果實，具有斂肺滋腎、生津收汗等功效。作為一種新型的“藥食同源”功能性保健食品，五味子富含多種營養(yǎng)成分和藥效成分。大麥芽是由禾本科植物大麥的成熟果實經(jīng)發(fā)芽干燥后炮制而成的[1]。發(fā)芽大麥含有豐富水解酶類，能使大分子淀粉和蛋白質(zhì)得以分解溶出。

中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會發(fā)布的《酵素產(chǎn)品分類導則》標準中，將酵素定義為以動物、植物和食用菌等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的可食用的酵素產(chǎn)品[2]。它不僅保留了原有的營養(yǎng)物質(zhì)，還能夠改良不良的風味。不同種類的酵素還會通過發(fā)酵代謝產(chǎn)生特有的生物活性成分。近年來，我國對果蔬類酵素發(fā)酵工藝進行了深入研究。楊婧娟等[3]以枸杞、蘆薈、山楂、薏苡仁、山藥和蘆薈為原料，開發(fā)新的酵素產(chǎn)品，獲得的最優(yōu)原料配方為蘆薈10.00%、枸杞45.29%、薏苡仁10%、山藥10%、山楂24.71%。最后得到了抗氧化活性和抑菌活性較高的復合型酵素產(chǎn)品；董潔等[4]利用酵母菌和乳酸菌發(fā)酵金絲小棗棗泥酵素，通過正交試驗得出接種0.1%酵母菌，30 ℃條件下發(fā)酵12 h之后，再接種0.5%乳酸菌，37 ℃條件下發(fā)酵28 h，最后把溫度控制在6～8 ℃條件下放置24 h，可得到感官評價較好，理化指標較為理想的金絲小棗棗泥酵素。YOON K Y等[5]使用4種乳酸菌對甜菜汁進行發(fā)酵，研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌更適合作為甜菜汁的發(fā)酵菌株。大量研究表明，酵素具有抗疲勞、抗衰老、抑菌消炎、提高機體免疫力、保護肝臟、降血脂、促進消化、抗氧化抗腫瘤、控制糖病、清除自由基、抗誘變突變等功能[6-8]。趙金鳳等[9]研究發(fā)現(xiàn)，敖東酵素可以顯著增強小鼠脾淋巴細胞的再生能力，對其免疫系統(tǒng)有一定的調(diào)節(jié)作用。楊志鵬等[10]試驗表明，海棠果酵素對清除人體內(nèi)膽固醇有較好的效果，其降解率為73.4%。

本試驗以新鮮的北五味子和麥芽為原料，以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為菌種，制備北五味子麥芽酵素；并對其超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活性以及體外抗氧化活性進行測定，以期為北五味子麥芽酵素綜合性開發(fā)提供相關依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北五味子、大麥芽：市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：購買于中國工業(yè)微生物種保藏中心；Pectinex Ultra Color果膠酶（10 000 U/mL）：諾維信（中國）生物技術有限公司；SOD酶活力檢測試劑盒、總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS法）：南京建成生物工程研究所；三羥甲基氨基甲烷：上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、無水碳酸鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、冰乙酸、維生素C（vitamin C，VC）等（均為分析純）：天津大茂化學試劑廠；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1100紫外可見分光光度計：上海凌析達儀器；HR7633打漿機：飛利浦家庭電器（珠海）有限公司；WS108手持式折光儀：河北潤聯(lián)科技開發(fā)有限公司；TD5Z低速平衡離心機：金壇市城西春蘭試驗儀器廠；HWS電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；DL-CJ-1N超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；EX324電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信試驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 北五味子麥芽酵素制備的工藝流程及操作要點

北五味子酶解：把北五味子果用水清洗干凈，果梗去除，打漿機破碎，添加1.6～2.0 mL/kg Pectinex Ultra Color果膠酶，在50 ℃條件下酶解2 h，60目絹布過濾，濾液冷卻備用。

麥芽糖化：大麥芽用磨粉機磨粉，過40目篩，浸入38～40 ℃溫水（料水比為1∶3）中浸泡40 min，再調(diào)整溫度至52 ℃，并浸泡30 min。隨后將溫度控制在63～65 ℃左右，經(jīng)過60 min，再次調(diào)節(jié)溫度至78 ℃，保溫20 min滅酶，然后用100目篩網(wǎng)過濾，冷卻備用。

殺菌：采用超聲波殺菌方式對其原料進行殺菌。將按一定比例配好的原液在超聲波下處理15 min后，冷卻至室溫后接種。

菌種活化：將植物乳桿菌接入已經(jīng)滅菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中活化，放在37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后取用。

接種、發(fā)酵：接入活化好的植物乳桿菌，在試驗設計的不同溫度和時間等條件培養(yǎng)下，進行靜置發(fā)酵，得到酵素產(chǎn)品。

1.3.2 單因素試驗

原料配比的確定：分別調(diào)整北五味子和麥芽的比例為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1（g∶g），在原料殺菌冷卻之后，接種2%的植物乳桿菌，在41 ℃條件下發(fā)酵3 d，測定其SOD酶活力，以確定最適原料比例。

發(fā)酵時間、溫度與接種量的確定：在北五味子∶麥芽為2∶1（g∶g）的條件下，分別調(diào)整植物乳桿菌的接種量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%），在不同溫度（35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃）條件下分別發(fā)酵1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，以SOD酶活力為評價指標，確定植物乳桿菌合適的發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度與接種量。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以SOD酶活力作為評價指標，采用L9（33）正交設計進行正交試驗，以確定其最佳的發(fā)酵工藝條件。正交試驗因素水平見表1。

表1 北五味子麥芽酵素發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Schisandra chinensis and malt Jiaosu fermentation condition optimization

1.3.4 測定方法

（1）SOD酶活力的測定：將酵素液3800r/min離心10min，根據(jù)SOD酶試劑盒的要求進行酶活力測定。

（2）ABTS+自由基清除能力的測定：根據(jù)試劑盒說明書進行測定，根據(jù)其標準曲線回歸方程y=-1.121 4x+1.126 2（R2=0.995 7）來計算清除能力，其中x為吸光度值，y為測試樣品的抗氧化能力。

（3）羥自由基（·OH）清除能力的測定：取0.1 mL樣品，加入2 mL 6 mmoL/L的H2O2溶液、FeSO4溶液，混合均勻，靜置10 min之后，加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液，再次混勻，37 ℃條件下水浴1 h，調(diào)節(jié)波長為510 nm，測定吸光度值A1。以去離子水為參比溶液，測定吸光度值A0。以同體積的蒸餾水代替水楊酸溶液，測定吸光度值A2[12]。根據(jù)下式計算羥自由基清除能力。

（5）DPPH自由基（DPPH·）清除能力的測定：在試管中加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液以及2 mL稀釋后的樣品溶液，25 ℃條件下避光30 min。用無水乙醇調(diào)零，調(diào)節(jié)波長為517 nm，測定其吸光度值A1?？瞻讓φ沼脽o水乙醇代替樣液，測定吸光度值A0，以等體積的無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測定吸光度值A2[13]。根據(jù)下式計算DPPH自由基清除能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 北五味子麥芽酵素原料配比的確定

圖1 不同原料配比對酵素超氧化物歧化酶活力的影響Fig.1 Effect of different raw material ratio on superoxide dismutase activity in Jiaosu

由圖1可知，北五味子∶麥芽=2∶1（g∶g）時，酵素產(chǎn)品中SOD酶活力最高可達3 263.21 U/mL，而后隨著北五味子的含量提高，SOD酶活力開始下降。因此，選擇最適的北五味子∶麥芽為2∶1（g∶g）。

2.1.2 北五味子麥芽酵素發(fā)酵時間的確定

圖2 發(fā)酵時間對酵素超氧化物歧化酶活力的影響Fig.2 Effect of fermentation time on superoxide dismutase activity in Jiaosu

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中SOD酶活力呈先上升后下降的趨勢。SOD酶活力在發(fā)酵第3天時達到最高值3 263.21 U/mL。第3天后SOD酶活力下降的原因可能是發(fā)酵后期菌體處于衰亡期導致營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，但又未及時補充，抑制了SOD酶的積累[14]。因此，選擇植物乳桿菌發(fā)酵制備北五味子麥芽酵素的適合發(fā)酵時間為3 d。

2.1.3 北五味子麥芽酵素發(fā)酵溫度的確定

圖3 發(fā)酵溫度對酵素超氧化物歧化酶活力的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on superoxide dismutase activity in Jiaosu

由圖3可知，SOD酶活力在35～39 ℃時變化不大，但當發(fā)酵溫度到達41 ℃時，SOD酶活力迅速上升，達到了最大值3 177.94 U/mL。而在發(fā)酵溫度高于41 ℃之后，SOD酶活力呈現(xiàn)大幅度的下降趨勢。因此，選擇植物乳桿菌的最適發(fā)酵溫度為41 ℃。

2.1.4 北五味子麥芽酵素接種量的確定

圖4 接種量對酵素中超氧化物歧化酶活力的影響Fig.4 Effect of inoculum on superoxide dismutase activity in Jiaosu

由圖4可知，隨著乳酸菌接種量的不斷增加，SOD酶活力表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。當接種量達到1.5%時，SOD酶活力達最大值，為3 464.80 U/mL；當接種量＞1.5%時，SOD酶活力逐漸降低。其原因可能是由于接種量過大，菌體正常代謝消耗的營養(yǎng)物質(zhì)較多，導致發(fā)酵產(chǎn)物減少。因此，選擇植物乳桿菌的最適接種量為1.5%。

2.2 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝條件

以接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為評價因素，SOD酶活力為評價指標進行正交試驗，結(jié)果見表2。

表2 北五味子麥芽酵素發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for Schisandra chinensis and malt Jiaosu fermentation condition optimization

由表2可知，對于SOD酶活力來說，影響該因素的主次順序為發(fā)酵溫度（A）＞接種量（B）＞發(fā)酵時間（C），由k值可知，北五味子麥芽酵素SOD酶活力最高的組合為A2B2C2，即發(fā)酵溫度41 ℃，接種量1.5%，發(fā)酵時間3 d。在此最佳條件下進行3次平行驗證試驗，北五味子麥芽酵素SOD酶活力為3 464.80 U/mL。

2.3 北五味子麥芽酵素抗氧化活性

為進一步明確北五味子麥芽酵素產(chǎn)品的抗氧化活性，測定了該酵素產(chǎn)品發(fā)酵前后對超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力，結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵前后清除自由基能力的變化Table 3 Changes of free radical scavenging ability before and after fermentation

由表3可知，發(fā)酵后超氧陰離子自由基的清除能力由發(fā)酵前的14.36%提高至發(fā)酵后的26.03%，但遠低于4 mg/mL維生素C對超氧陰離子自由基的清除力（87.78%），這可能與SOD和酚類物質(zhì)的上升有關；羥自由基清除率略有下降，但發(fā)酵前、后（99.54%、97.25%）均高于4 mg/mL維生素C對羥自由基清除率（73.21%）。北五味子麥芽酵素發(fā)酵后DPPH自由基清除率略有降低。這和KIM N J等[16]研究的馬鈴薯發(fā)酵飲料試驗有相似的結(jié)論。

發(fā)酵液中的ABTS+自由基清除力比原液略有升高，由0.598 0 mmol/L升至0.613 7 mmol/L，但遠低于4 mg/mL維生素C對ABTS+自由基的清除力（0.96 mmol/L）。可能是與發(fā)酵過程中SOD酶活力不斷增加有關[17]，EREL O[18]的研究表明，酚類物質(zhì)的濃度越高，其ABTS+自由基清除能力就越高。本試驗結(jié)果也與蔣增良等[19-20]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

植物乳桿菌發(fā)酵制備北五味子麥芽酵素的最優(yōu)工藝條件為：北五味子和麥芽的原料比為2∶1（g∶g），植物乳桿菌的接種量1.5%，在41 ℃的條件下發(fā)酵3 d，得到的酵素活性最高，SOD酶活力為3 464.80 U/mL；其對超氧陰離子自由基清除能力、羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和對ABTS+自由基清除能力分別達到了26.03%、97.25%、89.10%和0.613 7 mmol/L，表明該酵素具有較好的抗氧化活性。