殷 休，袁 博，劉應(yīng)保，高夢(mèng)祥

（長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 404325）

食用菌是具有高等子實(shí)體的一類(lèi)大型真菌，其種類(lèi)、數(shù)量繁多，富含多種活性成分，具有提高人體免疫力，抗腫瘤、降血脂等保健功效[1-4]。我國(guó)是食用菌生產(chǎn)大國(guó)，2017 年全國(guó)食用菌產(chǎn)量為3 712萬(wàn)t，其中香菇產(chǎn)量為986.51萬(wàn)t，產(chǎn)值為2 721.92億元，約占世界食用菌總產(chǎn)量的70%以上[5]。香菇味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，是我國(guó)著名的食用和藥用菌。目前，國(guó)內(nèi)外都很重視香菇功能性成分的開(kāi)發(fā)，如香菇呈味物質(zhì)[6]、香菇多糖[7]、香菇揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[1，8]、香菇藥理活性物質(zhì)[9]以及香菇可溶性膳食纖維[10]等。由于香菇的采收季節(jié)性很強(qiáng)，采收后容易發(fā)生腐敗，造成品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的損失。目前，香菇的加工多是當(dāng)?shù)仵r銷(xiāo)和制罐，其他類(lèi)型的深加工產(chǎn)品很少[6，10]，同時(shí)殘次香菇及傘柄等加工中的下腳料，被完全浪費(fèi)掉了，雖然目前香菇及傘柄等加工中的下腳料作為發(fā)酵原料制作酒精[11]、葡萄酒[12]、飲料[10]和調(diào)味品[6]等。但是，其利用率還不高，產(chǎn)品的種類(lèi)還不豐富且附加值高的產(chǎn)品偏少。所以，香菇的綜合利用迫在眉睫，其開(kāi)發(fā)前景廣闊。

黑曲霉（Aspergillus niger）是一種常見(jiàn)的曲霉屬真菌，廣泛分布在谷物、空氣、土壤等，黑曲霉是公認(rèn)安全的微生物[13]，且黑曲霉生長(zhǎng)較快[14]，產(chǎn)酶周期短[15]，用其生產(chǎn)的酶，種類(lèi)豐富、安全可靠、不產(chǎn)生毒素[15-16]，因此采用黑曲霉生產(chǎn)的纖維素酶特異性高，反應(yīng)條件比較溫和，能作用于香菇細(xì)胞壁，將蛋白質(zhì)、功能性多糖等大分子物質(zhì)釋放出來(lái)[17]。

本試驗(yàn)以香菇殘次品為主要原料，采用黑曲霉產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵，對(duì)黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基組成進(jìn)行了研究，探討了不同培養(yǎng)基組成對(duì)所產(chǎn)纖維素酶活的影響，為香菇的綜合利用提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）：由長(zhǎng)江大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 化學(xué)試劑

羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）、檸檬酸、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS），氫氧化鈉，葡萄糖，檸檬酸三鈉、鹽酸、酒石酸鉀鈉、苯酚（重蒸）、無(wú)水亞硫酸鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：將馬鈴薯去皮、洗凈、切成小塊，稱(chēng)取200 g加入1 000 mL蒸餾水，煮沸20 min，用紗布過(guò)濾，濾液補(bǔ)足水至1 000 mL，再加入糖和瓊脂，熔化后分裝，pH 自然。121 ℃滅菌25 min。

纖維素培養(yǎng)基：CMC 5.0 g，Na2HPO46.0 g，K2HPO44.0 g，（NH4）SO42.0 g，瓊脂15.0 g，礦物鹽溶液500 mL，蒸餾水500 mL，pH 自然。121 ℃滅菌25 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-5-C高速冷凍離心機(jī)：上海市離心機(jī)械研究所；ET-2010KA立式雙門(mén)回旋搖床：金壇市億通電子有限公司；UV-1800紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；HH-4恒溫水浴鍋、BS-IE振蕩培養(yǎng)箱：國(guó)華電器有限公司；HFsafe-1200超凈工作臺(tái)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；HVE-50立體式高壓滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；YE4A349120移液槍?zhuān)罕本┙鸹▋x器有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 孢子懸液的制備

吸取20 mL無(wú)菌水加入到黑曲霉斜面試管上，用接種環(huán)將試管斜面上的孢子輕輕刮下，倒入帶有四層擦鏡紙的滅菌漏斗中過(guò)濾，然后將過(guò)濾的黑曲霉菌液倒入滅菌盛有小玻璃珠的50 mL三角瓶中，重復(fù)3次，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)15 min，將孢子充分打散，得到單孢子懸液。

1.3.2 培養(yǎng)方法

將香菇殘次品切成丁，加入一定量的蒸餾水，用高速勻漿機(jī)打成漿，采用121 ℃高壓汽滅菌30 min，冷卻，接入2 mL的黑曲霉孢子懸液，在30 ℃發(fā)酵一定時(shí)間后取發(fā)酵液，10 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定纖維素酶活。

1.3.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[16]

在不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液中各加入DNS溶液1.5 mL，混合液于沸水浴中煮沸5 min，冷卻后加蒸餾水定容至25 mL，搖勻，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定光密度（OD540nm）值，并以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x），OD540nm值為縱坐標(biāo)（y）繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.464 7x-0.047 0（R2=0.983 4）。

1.3.4 纖維素酶酶活測(cè)定

纖維素酶活測(cè)定采用還原糖法即CMC-DNS法[16，18-19]。取發(fā)酵后的粗酶液1 mL，加到2 mL、1%的CMC溶液（pH 4.8的0.05 mol/L檸檬酸緩沖液配制），于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)0.5 h，取出加入3 mL DNS顯色液，沸水浴10 min測(cè)定還原糖的含量。羧甲基纖維素酶活力（sodium carboxymethyl cellulose activity，CMCA）計(jì)算公式如下：

式中：X表示羧甲基纖維素酶活力，U/mL；m表示從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖含量，mg；N表示酶液稀釋倍數(shù)，2表示時(shí)間單位換算。

羧甲基纖維素酶活力定義：1 g固體酶（或1 mL液體酶），在（50±0.1）℃、指定pH條件下（酸性纖維素酶pH 4.8，中性纖維素酶pH 6.0），1 h水解羧甲基纖維素鈉底物，產(chǎn)生出相當(dāng)于1 mg葡萄糖的還原糖量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.5 黑曲霉產(chǎn)纖維素酶曲線

將2 mL黑曲霉單孢子懸液接入到50 mL香菇液體培養(yǎng)基中，在30 ℃下、150 r/min振蕩培養(yǎng)。從第2天起，每隔24 h取樣，測(cè)定發(fā)酵液的纖維素酶活，繪制黑曲霉產(chǎn)纖維素酶曲線，確定黑曲霉液態(tài)發(fā)酵時(shí)間。

1.3.6 培養(yǎng)基成分優(yōu)化單因素試驗(yàn)

香菇與水料水比對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響：分別按照香菇與水料水比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g∶mL），接入2 mL的孢子懸液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)120 h后測(cè)定酶活。

麥芽糖添加量對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響：在香菇液培養(yǎng)基中加入麥芽糖，使其質(zhì)量濃度分別為0、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L，接入2 mL的孢子懸液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)120 h后測(cè)定酶活。

蛋白胨添加量對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響：在香菇液培養(yǎng)基中加入蛋白胨，使其質(zhì)量濃度分別為0.25 g/L、0.50 g/L、0.75 g/L、1.00 g/L、1.25 g/L，接入2 mL 的孢子懸液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)120 h后測(cè)定酶活。

酵母膏添加量對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響：確定最佳麥芽糖和蛋白胨的添加量基礎(chǔ)上，在香菇液培養(yǎng)基中加入酵母膏，使其質(zhì)量濃度分別為0.25 g/L、0.50 g/L、0.75 g/L、1.00 g/L、1.25 g/L，接入2 mL 的孢子懸液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)120 h后測(cè)定酶活。

1.3.7 培養(yǎng)基成分優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

選取香菇與水料水比（A）、麥芽糖添加量（B）、蛋白胨添加量（C）、酵母膏添加量（D）4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以羧甲基纖維素酶酶活（Y）為響應(yīng)值，其因素水平設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉產(chǎn)纖維素酶曲線

發(fā)酵液的纖維素酶活隨發(fā)酵時(shí)間的變化結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在48～120 h范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，黑曲霉在香菇培養(yǎng)基中產(chǎn)纖維素酶活隨之增加，并在發(fā)酵時(shí)間120 h時(shí)達(dá)到最高，為9.21 U/mL，發(fā)酵時(shí)間＞120 h 之后呈平穩(wěn)趨勢(shì)。因此，黑曲霉產(chǎn)纖維素酶最佳發(fā)酵時(shí)間為120 h。

圖1 黑曲霉產(chǎn)纖維素酶曲線Fig.1 Curve of cellulase production by Aspergillus niger

2.2 培養(yǎng)基成分優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 香菇與水比例對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響

不同的香菇與水比例對(duì)纖維素酶活的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，香菇與水比例為1∶6～1∶10（g∶mL）范圍時(shí)，纖維素酶活逐漸增加；香菇與水比例為1∶10（g∶mL）時(shí)，纖維素酶活最高，為9.37 U/mL；香菇與水比例在1∶10～1∶14（g∶mL）范圍時(shí)，纖維素酶活逐漸降低。因此，香菇與水比例1∶10（g∶mL）為宜。

圖2 香菇與水比例對(duì)黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.2 Effect of Lentinus edodes to water ratio on cellulase production by Aspergillus niger

2.2.2 麥芽糖添加量對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在麥芽糖、葡萄糖、乳糖和蔗糖這4種碳源的情況下，黑曲霉產(chǎn)酶對(duì)麥芽糖作為碳源的利用效果最高。麥芽糖添加量對(duì)纖維素酶活的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著麥芽糖添加量的增加，纖維素酶活也在增加。達(dá)到1 g/L 時(shí)，纖維素酶活為9.48 U/mL，再增加其添加量對(duì)纖維素酶活影響并不顯著?？紤]到成本，因此，選擇麥芽糖添加量1 g/L為最佳。

圖3 麥芽糖添加量對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響Fig.3 Effect of maltose addition on cellulase production by Aspergillus niger

2.2.3 蛋白胨添加量對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在蛋白胨、尿素、硫酸銨和硝酸鈉這4種氮源的情況下，黑曲霉產(chǎn)酶對(duì)蛋白胨作為氮源的利用效果最高。蛋白胨添加量對(duì)纖維素酶活的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著蛋白胨添加量的增加，纖維素酶活也在增加。達(dá)到0.75 g/L 時(shí)，纖維素酶活為9.95 U/mL，再增加其添加量對(duì)纖維素酶活影響并不顯著?？紤]到成本，因此，選擇蛋白胨添加量0.75 g/L為最佳。

圖4 蛋白胨添加量對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響Fig.4 Effect of peptone addition on cellulase production by Aspergillus niger

2.2.4 酵母膏添加量對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響

酵母膏作為生長(zhǎng)因子，其添加量對(duì)纖維素酶活的影響結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，隨著酵母膏添加量的增加，纖維素酶活也在增加。達(dá)到0.75 g/L時(shí)，纖維素酶活為10.19 U/mL，再增加其添加量對(duì)纖維素酶活影響并不顯著?？紤]到成本，因此，選擇酵母膏添加量0.75 g/L為最佳。

圖5 酵母膏添加量對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響Fig.5 Effect of yeast extract addition on cellulase production by Aspergillus niger

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析

選取香菇與水料水比（A）、麥芽糖添加量（B）、蛋白胨添加量（C）、酵母膏添加量（D）4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面（Box-Behnken）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以羧甲基纖維素酶酶活（Y）為響應(yīng)值，Box-Behnken試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-behnken experiments

通過(guò)Design Expert 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，獲得香菇與水料水比、麥芽糖、蛋白胨和酵母膏對(duì)纖維素酶活的二次回歸方程：

表3 二次回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of quadratic regression model

由表3可知，該模型P=0.002 5＜0.01，失擬項(xiàng)P＞0.05，表明該模型回歸顯著，失擬性不顯著，因而無(wú)失擬因素存在。一次項(xiàng)A、D、交互項(xiàng)AB、BC、CD、二次項(xiàng)B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）?；貧w方程決定系數(shù)R2=0.917 5，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.835 1，表明方程擬合較好。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=8.23%，表示試驗(yàn)的精確度較高，試驗(yàn)操作可信。

Design Expert8.0軟件得到三維響應(yīng)面分析見(jiàn)圖6。等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強(qiáng)弱大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。由圖6可知，麥芽糖與香菇與水料水比、麥芽糖與蛋白胨、酵母膏與麥芽糖的交互作用等高線均呈橢圓形，表明以上交互作用均對(duì)纖維素酶活影響顯著。

為當(dāng)麥芽糖量固定時(shí)，纖維素酶活隨著香菇與水料水比呈先增大后減小的趨勢(shì)；當(dāng)香菇與水料水比固定時(shí)，纖維素酶活隨麥芽糖量的增加也呈先增大后減小的趨勢(shì)。

當(dāng)麥芽糖量固定時(shí)，纖維素酶活隨著蛋白胨量呈先增大后減小的趨勢(shì)；當(dāng)?shù)鞍纂肆抗潭〞r(shí)，纖維素酶活隨麥芽糖量的增加也呈先增大后減小的趨勢(shì)。

圖6 各因素交互作用對(duì)黑曲霉產(chǎn)纖維素酶影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on cellulase production by Aspergillus niger

當(dāng)酵母膏量固定時(shí)，纖維素酶活隨著麥芽糖量呈先增大后減小的趨勢(shì)；當(dāng)麥芽糖量固定時(shí)，纖維素酶活隨著酵母膏量也呈先增大后減小的趨勢(shì)。

2.4 最佳培養(yǎng)條件的確定及其驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)回歸方程求解，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：香菇與水比例為1∶9.09（g∶mL），麥芽糖添加量為0.91 g/L，蛋白胨添加量為0.66 g/L，酵母膏添加量為0.50 g/L。纖維素酶活預(yù)測(cè)值為12.95 U/mL。為方便實(shí)際操作，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：香菇與水比例為1∶9（g∶mL），麥芽糖添加量為0.9 g/L，蛋白胨添加量為0.7 g/L，酵母膏添加量為0.5 g/L進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得纖維素酶活平均值為13.15 U/mL，預(yù)測(cè)誤差為1.52%。表明培養(yǎng)基優(yōu)化模型是有效的。

3 結(jié)論

在纖維素酶的生產(chǎn)過(guò)程中，影響酶產(chǎn)量的因素很多，這些因素之間不是孤立的，而是相互聯(lián)系的。本研究選取香菇與水料水比、麥芽糖添加量、蛋白胨添加量和酵母膏添加量4個(gè)因素，利用響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組成。結(jié)果表明，在培養(yǎng)基組成為香菇與水比例為1∶9（g∶mL），麥芽糖添加量為0.9 g/L，蛋白胨添加量為0.7 g/L，酵母膏添加量為0.5 g/L的條件下，發(fā)酵得纖維素酶活為13.15 U/mL，比培養(yǎng)基未優(yōu)化前提高了22.5%。表明用這種方法來(lái)優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，能夠使酶活得到一定的提高，為香菇殘次品的綜合利用提供了一定的理論依據(jù)。