金 剛，王建芳

（1.武陟濟民醫(yī)院 檢驗科，河南 焦作 454950；2.駐馬店市中心醫(yī)院 檢驗科，河南 駐馬店 463000）

慢性乙型肝炎（CHB）為臨床多發(fā)疾病類型，乙型肝炎病毒（HBV）所致肝損傷與轉歸情況和機體細胞免疫間具有密切相關性，主要為T淋巴細胞清除病毒及肝細胞損傷，效應CD4+T淋巴細胞為機體免疫應答重要部分，于免疫調(diào)節(jié)中具有關鍵作用[1]。隨生物學及免疫學技術不斷發(fā)展，CD4+T淋巴細胞另外兩個亞群輔助性T淋巴細胞17（Th17） 及調(diào)節(jié)性T細胞 （Treg） 在CHB患者中的促炎及抗炎作用得到證實[2]。Treg細胞約占正常機體外周血CD4+T細胞總數(shù)目的5%～10%，主要功能為維持自身免疫耐受及調(diào)節(jié)自身T細胞功能，其活化后可分泌IL-10、TGF-β1及其他可溶性細胞因子，并通過對樹狀突細胞成熟予以抑制及細胞間直接接觸而發(fā)揮免疫抑制功能。Th17則可分泌IL-17等，其中IL-17為主要效應因子，可促使樹狀突細胞成熟、T細胞活化等，以此參與宿主抗感染免疫，還可增加基質(zhì)金屬蛋白酶、趨化因子及促炎因子等含量，引發(fā)組織細胞浸潤等。Treg/Th17比值紊亂為多種腫瘤、自身免疫病變及炎性疾病發(fā)生的重要原因，基于此，本研究選取我院116例CHB患者，探討不同病情程度患者間血清Treg/Th17水平及其意義，現(xiàn)報告如下。

資料與方法 一、一般資料 選取我院2017年11月-2018年12月CHB患者116例設為研究組，另選取同期于我院進行健康體檢者116例設為對照組。研究組男82例，女34例；年齡23～63歲，平均（57.20±7.69） 歲；病情程度：輕中度77例，重度39例。對照組男79例，女37例；年齡21～66歲，平均（56.91±7.92） 歲。2組性別、年齡等臨床資料均衡可比（P＞0.05）。

二、選取標準 1.納入標準 ⑴研究組符合CHB及病情程度診斷標準[3]；⑵對照組抗HIV抗體試驗、丙肝抗體等檢查均呈陰性，且無肝炎癥狀；⑶知曉本研究，簽署同意書。

2.排除標準 ⑴合并惡性腫瘤者；⑵妊娠期及哺乳期女性；⑶合并脂肪性肝炎、酒精性肝炎及藥物性肝炎者；⑷合并血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、自身免疫系統(tǒng)重度病變者；⑸合并其他全身性重度感染性疾病者。

方 法 設備選取FACSCalibur流式細胞儀、AU5800型全自動生化分析儀、淋巴細胞分離液、FoxP3試劑盒（含有配套固定/透膜劑） 與PE所標記抗人FoxP3抗體和對應同型對照、IL-17檢測所用固定/透膜劑、PE所標記抗人IL-17抗體和對應同型對照、莫能霉素、離子霉素、佛波脂，胎牛血清、RPM I 1640；抽取所有受檢者空腹靜脈血4m L，經(jīng)肝素抗凝，以淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，分選CD4+T細胞，制為懸液（細胞濃度：1×107/m L）；取100μL所選CD4+T細胞液置于流式試管，加新鮮配置固定/透膜劑（1m L），于4℃條件下避光反應60m in，經(jīng)透膜緩沖液洗滌、重懸，將其分別放入2個試管內(nèi)，各加入FoxP3-PE與對應同型對照IgG1-PE 10μL，于室溫條件下避光反應30m in，洗滌3次，經(jīng)PBS 300μL重懸細胞，測定 Treg百分比；取100μL所選CD4+T細胞液懸浮于900μL RPM I 1640培養(yǎng)液，加入2umol/L莫能霉素、1ug/m L離子霉素、50 ng/m L佛波脂，置于5%二氧化碳、37℃環(huán)境內(nèi)培育5h，取100μL置于專用流式試管，加入固定/透膜劑A100μL，于室溫條件下避光反應15min，洗滌1次，加入固定/透膜劑B100μL，于室溫條件下避光反應5m in，將其分為2管，加入IL-17 PE與對應同型對照IgG1-PE，于室溫條件下避光反應30m in，洗滌2次，經(jīng)PBS 300μL重懸細胞，測定Th17百分比。

四、觀察指標 ⑴統(tǒng)計分析研究組與對照組Treg及Th17百分比、Treg/Th17。⑵統(tǒng)計分析研究組不同病情程度患者Treg及Th17百分比、Treg/Th17。⑶統(tǒng)計分析 Treg及 Th17百分比、Treg/Th17與CHB病情程度相關性。

五、統(tǒng)計學方法 通過SPSS18.0對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料（±s）表示，t檢驗，Treg及Th17百分比、Treg/Th17與CHB病情程度相關性以Pearson予以分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果 一、研究組與對照組各指標水平比較研究組Treg及Th17百分比高于對照組，Treg/Th17低于對照組（P＜0.05），見表1。

二、不同病情程度CHB患者各指標水平比較 重度CHB患者Treg及Th17百分比高于輕中度患者，Treg/Th17低于輕中度患者（P＜0.05），見表2。

三、各指標水平與CHB病情程度相關性分析 Pearson檢驗可知，Treg及Th17百分比與CHB病情程度間存在明顯正相關關系（P＜0.05），Treg/Th17與CHB病情程度間存在明顯負相關關系（P＜0.05），見表3。

討 論 CHB發(fā)病及進展和轉歸為肝細胞、HBV和宿主免疫系統(tǒng)互相作用的動態(tài)平衡過程，研究指出，HBV侵襲機體肝細胞后發(fā)生復制，分泌的抗原引起機體免疫應答，Th17細胞及Treg細胞等免疫因子在上述過程中均有重要作用[4]。

近些年，Th17及Treg細胞于自身免疫性病變及炎癥中的重要作用得到普遍重視，Treg細胞屬CD4+T細胞亞群，主要功能為調(diào)節(jié)控制病原體T細胞反應及造成重度炎癥、組織破壞的過度T細胞反應間平衡；Th17為臨床新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞型，具備IL-23依賴性生成IL-17等特征，促炎癥作用較強，在多種慢性炎癥、自身免疫病變發(fā)生與進展中具有重要作用[5]。Th17細胞及Treg細胞間相互作用較復雜，Th17及Treg與其所分泌細胞因子間構成一個網(wǎng)絡，給予所需細胞因子后，可出現(xiàn)Th17及Treg細胞分化偏離，進而對兩者數(shù)目、功能平衡產(chǎn)生影響。IL-2為關鍵分子，經(jīng)信號轉導及轉錄激活因子5途徑，對Th17細胞分化予以抑制、對Treg細胞生成予以促進，而IL-21可影響Foxp3表達，阻止Treg細胞生成產(chǎn)生抑制作用，并經(jīng)自分泌途徑促使Th17發(fā)育及其與Treg細胞間平衡。同時，Th17及Treg細胞分別起促炎及抑制作用，兩者間平衡發(fā)生紊亂為腫瘤及自身免疫病變等發(fā)生及進展的重要因素。

本研究結果表明，研究組Treg及Th17百分比高于對照組，Treg/Th17低于對照組（P＜0.05），主要是因Treg及Th17數(shù)目雖增高，但Treg細胞增多速度低于Th17細胞，故致使Treg/Th17降低，表明CHB患者機體處于Th17細胞增多狀態(tài)，且趨于優(yōu)勢地位的Treg/Th17免疫失衡，推測Treg細胞增殖及功能不足、Th17細胞異?；罨赡転楦闻K炎癥反應發(fā)生與進展的重要因素。此外，黃進發(fā)等[6]研究指出，Treg和Th17的發(fā)育情況為特定核轉錄因子RORγt、Foxp3所決定，其中Foxp3為Treg特異性標志物，可調(diào)節(jié)Treg發(fā)育和功能，可對自身反應性T淋巴細胞增殖及活化予以主動抑制，以此控制T淋巴細胞對異體抗原或自身抗原過度反應；RORγt為調(diào)節(jié)Th17分化的重要轉錄因子，可對T淋巴細胞分化為Th17產(chǎn)生誘導作用，而其研究結果顯示，CHB患者 RORγt、Foxp3表達高于對照組。另由本研究結果顯示，不同CHB患者間Treg及Th17表達情況、Treg/Th17間存在顯著差異，且Treg及Th17百分比與CHB病情程度存在正相關關系，Treg/Th17與其存在負相關關系（P＜0.05），提示隨CHB患者病情加劇，Treg及Th17百分比持續(xù)增高，Treg/Th17比值呈降低趨勢，臨床可通過測定其表達情況評估CHB患者病情程度，據(jù)此制定、調(diào)整治療方案，確保治療有效性及合理性。

表1 研究組與對照組各指標水平比較（±s）

表1 研究組與對照組各指標水平比較（±s）

組別 例數(shù) Treg（%） Th17（%） Treg/Th17研究組 116 7.27±0.51 2.13±0.10 3.41±0.39對照組 116 5.59±0.54 0.51±0.08 10.96±0.44 t值 24.361 136.246 138.301 P值 0.000 0.000 0.000

表2 不同病情程度CHB患者各指標水平比較（±s）

表2 不同病情程度CHB患者各指標水平比較（±s）

病情程度 例數(shù) Treg（%） Th17（%） Treg/Th17輕中度 77 6.69±0.49 1.38±0.08 4.85±0.43重度 39 7.81±0.50 2.87±0.11 2.72±0.38 t值 11.551 83.214 26.177 P值 0.000 0.000 0.000

表3 各指標水平與CHB病情程度相關性分析（n=116）

綜上所述，CHB患者Th17及Treg百分比異常增高、Treg/Th17顯著降低，且在不同病情程度患者間存在明顯差異，Treg及Th17百分比與CHB病情程度間存在明顯正相關關系，Treg/Th17與CHB病情程度間存在明顯負相關關系，可為臨床治療方案的制定提供參考依據(jù)。