陳偉燕，鄧武堅(jiān)，楊其霖

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 1.重癥醫(yī)學(xué)科；2.普外科，廣東 廣州 510260）

冠脈再灌注治療仍然是目前急性心肌梗死、穩(wěn)定或不穩(wěn)定性心絞痛等冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的主要治療手段。但是統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)仍有10%的患者在接受了成功的介入治療后出現(xiàn)冠脈再狹窄[1]。眾所周知，血管損傷，尤其是內(nèi)皮損傷是球囊擴(kuò)張術(shù)后再狹窄的主要原因。內(nèi)皮具有維持血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，調(diào)節(jié)血細(xì)胞-血管壁相互作用，抑制血栓形成，調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)等的作用。內(nèi)皮損傷誘發(fā)損傷的自我修復(fù)，引起血管平滑肌細(xì)胞遷移至動(dòng)脈內(nèi)膜、增殖，合成細(xì)胞外基質(zhì)，過(guò)度的修復(fù)最終引起血管腔的狹窄，血管舒縮功能受影響，順應(yīng)性明顯下降[2]。

大量的研究報(bào)道腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system,RAS） 在血管再狹窄過(guò)程中具有重要的作用。特別是血管緊張素（angiotensin,ANG）II被證實(shí)具有明顯的加劇血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)沉積的作用[3-4]。而作為RAS家族的新成員，ANG-（1-7）被認(rèn)為具有與ANG II相反的作用，可減輕血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，減少血管外基質(zhì)沉積，影響凋亡，減輕動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄[5]。本研究主要通過(guò)持續(xù)給予ANG-（1-7）4周，觀察ANG-（1-7）對(duì)球囊損傷后血管再狹窄的影響，及是否具有改善內(nèi)皮依賴的血管舒張作用。

資料與方法

一、一般材料

ANG-（1-7）與A-779購(gòu)于美國(guó)Bachem公司；滲透壓微型泵（型號(hào)2m l4） 和球囊導(dǎo)管購(gòu)于Durect公司；阿司匹林來(lái)自拜耳公司生產(chǎn)。

二、動(dòng)物及分組

24只健康新西蘭白兔，雌雄不限，重約1.7～2.2kg。所有動(dòng)物行腹主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后隨機(jī)分為3組，每組8例：⑴對(duì)照組：術(shù)后經(jīng)滲透壓微型泵持續(xù)靜脈給予生理鹽水2.5μL/h，共4周；⑵ANG-（1-7）組：術(shù)后經(jīng)滲透壓微型泵持續(xù)靜脈給予ANG-（1-7）576μg·kg-1·d-1，共4周；⑶ANG-（1-7）+A-779組：以下簡(jiǎn)稱A-779組，術(shù)后經(jīng)滲透壓微型泵持續(xù)靜脈給予ANG-（1-7）576μg·kg-1·d-1和A-779 576μg·kg-1·d-1共4周。

三、腹主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)

所有動(dòng)物術(shù)前1d開(kāi)始給予阿司匹林50mg口服，術(shù)前12h開(kāi)始禁食，4h開(kāi)始禁水。用3%戊巴比妥鈉（1m l/kg） 靜脈注射進(jìn)行麻醉并固定于手術(shù)臺(tái)上。右側(cè)腹股溝備皮，消毒，鋪巾后在股動(dòng)脈搏動(dòng)最明顯處行縱切口，分離股動(dòng)脈，應(yīng)用21號(hào)橈動(dòng)脈穿刺針穿刺，導(dǎo)入導(dǎo)引鋼絲，并沿導(dǎo)引鋼絲置入4F橈動(dòng)脈鞘。回抽證實(shí)血流通暢后注入肝素鈉200U/kg肝素化。接心電生理記錄儀記錄心率（heart rate,HR）、血壓（blood pressure,BP）。然后經(jīng)動(dòng)脈鞘置入導(dǎo)引鋼絲至膈下，沿導(dǎo)絲送入3.5mm×23mm球囊至腹主動(dòng)脈膈下處，用壓力泵以15個(gè)大氣壓充盈球囊，回抽球囊至有阻力，釋放球囊內(nèi)壓力，如此反復(fù)3次，每次間隔1m in。拔除動(dòng)脈鞘管后局部縫合包扎。另外頸部皮膚備皮，消毒鋪巾后分離暴露頸靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，在中間作一小切口，將滲透壓微型泵裝好藥后通過(guò)導(dǎo)管連接于頸靜脈近心端，縫線固定，并把滲透壓微型泵埋于附近皮下，縫合皮膚。術(shù)后通過(guò)耳緣靜脈給予肝素鈉5000U，并肌注慶大霉素8萬(wàn)U/d，連續(xù)3d。術(shù)后一直口服阿司匹林50mg/d[6]。

四、腹主動(dòng)脈血流頻譜測(cè)定

球囊損傷術(shù)前、術(shù)后和4周后，暴露腹主動(dòng)脈，在右腎動(dòng)脈開(kāi)口上方約1cm處，利用多導(dǎo)生理記錄儀（Biopac Systems Inc）超聲探頭記錄局部血流頻譜，包括收縮期峰值流速（peak systolic velocity,PSV）、舒張末期流速（end diastolic velocity,EDV）和平均血流速度（mean velocity,Vmean）。而阻力指數(shù)（resistance index,RI）和搏動(dòng)指數(shù)（pulse index,PI）通過(guò)以下公式計(jì)算：RI=（PSV-EDV）/PSV；PI=（PSV-EDV） /Vmean。其中球囊損傷前后4周后分別持續(xù)記錄5m in，球囊損傷術(shù)后持續(xù)記錄15m in。

五、HE染色計(jì)算新生內(nèi)膜及狹窄率

術(shù)后4周取右腎動(dòng)脈開(kāi)口上方1cm處腹主動(dòng)脈行石蠟切片，然后用蘇木精-伊紅（HE）染色。HE染色玻片在顯微鏡下拍照，用Image Pro-Plus軟件進(jìn)行分析，計(jì)算官腔面積、內(nèi)彈力板周徑、外彈力板周徑、內(nèi)膜和中膜厚度。內(nèi)膜厚度=（內(nèi)彈力板周徑-管腔周徑） /2π；中膜厚度=（外彈力板周徑-內(nèi)彈力板周徑） /2π。新生內(nèi)膜面積=內(nèi)彈力板圍繞面積-管腔面積。狹窄率=新生內(nèi)膜面積/（管腔面積+新生內(nèi)膜面積）×100%。每張切片測(cè)量3次，取平均值[7]。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、球囊損傷后血流頻譜隨時(shí)間的短期變化情況

如圖1，球囊損傷后即刻，通過(guò)多導(dǎo)心電生理記錄儀可記錄到損傷血管局部Vmean和RI在術(shù)后1min，3min，5m in，7m in，10m in和15m in始終保持穩(wěn)定，而EDV和舒張壓（diastolic blood pressure,DBP）隨時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸升高趨勢(shì)，直到10m in開(kāi)始較1m in和3m in出現(xiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。另一方面，PSV和PI隨時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸下降趨勢(shì)，直到10m in開(kāi)始較1m in和3m in出現(xiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。而SBP（systolic blood pressure,SBP） 和心率在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

二、ANG-（1-7）可改善球囊損傷引起的血管舒張受限

如圖2所見(jiàn)，基線和術(shù)后即刻的BP，HR，PSV，EDV，Vmean，RI，PI在各組間無(wú)明顯差異。球囊損傷后即刻可引起各組局部血管PSV較術(shù)前明顯升高 （P＜0.05），而EDV和Vmean明顯下降（P＜0.05）。其中術(shù)后即刻的PSV在對(duì)照組為（81.57±21.55）cm/s，在ANG-（1-7）組為（76.73±14.36） cm/s。RI[對(duì)照組：術(shù)后 （1.25±0.08） vs.術(shù)前 （1.14±0.06），P＜0.05；ANG-(1-7)組：術(shù)后（1.13±0.11） vs.術(shù)前 （1.05±0.11），P＜0.05]和PI[對(duì)照組：術(shù)后（6.41±1.21） vs.術(shù)前（3.97±0.82），P＜0.05；ANG-（1-7）組：術(shù)后 （5.46±1.74） vs.術(shù)前 （3.12±0.80），P＜0.05]在各組也較術(shù)前明顯升高。

4周后，PSV和Vmean在各組均較術(shù)前和術(shù)后即刻出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05）。而EDV，RI和PI均較術(shù)后有不同程度下降（P＜0.05），但較基線變化不明顯 （P＞0.05）。持續(xù)給予ANG-（1-7）周，與對(duì)照組比較可明顯降低RI[（0.99±0.10） vs.（1.13±0.08），P＜0.05]和PI[（2.90±0.60） vs.（5.19 ±1.83），P＜0.05]。ANG-（1-7） 特異性受體拮抗劑A-779可部分逆轉(zhuǎn)ANG-（1-7）對(duì)PI的作用[（4.15±1.3） vs.（2.90±0.60），P＜0.05]。球囊損傷后4周的BP和HR在各組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

三、ANG-（1-7）對(duì)球囊損傷后血管內(nèi)膜的影響

圖1 球囊損傷后血流動(dòng)力學(xué)的變化

圖2 ANG-（1-7）對(duì)球囊損傷后血流動(dòng)力學(xué)的影響

靜脈持續(xù)給予ANG-（1-7）4周后，HE染色可見(jiàn)，見(jiàn)圖3，球囊損傷引起新生血管內(nèi)膜形成。表1數(shù)據(jù)說(shuō)明，ANG-（1-7）較對(duì)照組可明顯減輕新生內(nèi)膜厚度 [（0.21±0.02） μm vs.（0.52±0.02） μm，P＜0.05]，新生內(nèi)膜面積 [（0.29±0.01） mm2vs.（0.50±0.02） mm2，P＜0.05]和管腔狹窄率[（29.9±2.7） %vs.（43.2±2.9） %，P＜0.01]，而對(duì)中膜厚度沒(méi)有影響（P＞0.05）。A-779可在一定程度上抵消ANG-（1-7）的保護(hù)作用（P＜0.05）。

圖3 腹主動(dòng)脈HE染色（20×20）

表1 球囊損傷4周后新生內(nèi)膜情況（±s）

表1 球囊損傷4周后新生內(nèi)膜情況（±s）

注：*vs.對(duì)照組，P＜0.05；＃vs.ANG-(1-7)組，P＜0.05。

對(duì)照組n 8管腔直徑（mm） 2.56±0.09 ANG-(1-7)組8 3.87±0.10*A-779組8 3.04±0.06*#新生內(nèi)膜厚度（mm） 0.52±0.02 0.21±0.02* 0.40±0.03*#中膜厚度 （mm） 0.38±0.03 0.38±0.02 0.37±0.03新生內(nèi)膜面積（mm2）0.50±0.02 0.29±0.01*0.39±0.01*#狹窄率（%） 43.2±2.9 29.9±2.7*37.0±2.3*#

討 論

血管損傷可致內(nèi)皮依賴性血管舒張受損，進(jìn)而發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化或血管再狹窄。而球囊損傷后血管再狹窄的機(jī)制十分復(fù)雜，其中包括了血管收縮、重構(gòu)、內(nèi)膜增生、血管平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積等[2]。RAS系統(tǒng)被認(rèn)為在血管再狹窄中扮演重要角色。ANG II通過(guò)作用于血管緊張素受體可引起細(xì)胞表型改變、促進(jìn)細(xì)胞增生，甚至通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大、纖維化等[4]。

ANG-（1-7）作為RAS系統(tǒng)中的活性七肽，已被報(bào)道具有多種心血管保護(hù)作用。Freeman等人發(fā)現(xiàn)ANG-（1-7）可以抑制血清或血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子和ANG II刺激導(dǎo)致的血管平滑肌細(xì)胞的增殖[7]。Tallant等人報(bào)道ANG-（1-7）可抑制ANG II激活的絲裂酶原反應(yīng)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶反應(yīng)[8]。我們既往的研究也發(fā)現(xiàn)ANG-（1-7）可減輕血管損傷后的血管再狹窄[9]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，ANG-（1-7）可明顯減輕球囊損傷所致的血管內(nèi)膜形成及管腔狹窄，說(shuō)明ANG-（1-7）具有減輕血管非正常損傷修復(fù)的作用。眾所周知，內(nèi)皮具有維持血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，調(diào)節(jié)血管舒縮的功能。尤其是血管的舒張功能依賴于內(nèi)皮功能的完整，血管內(nèi)皮受損或修復(fù)異常，均可引起內(nèi)皮依賴的舒張功能失調(diào)。PSV和EDV作為心血管疾病的危險(xiǎn)因素已有較多報(bào)道[10-11]。Chuang等人發(fā)現(xiàn)頸總動(dòng)脈EDV與頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度呈負(fù)相關(guān)，而頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化疾病的不良標(biāo)志[12]。本研究通過(guò)觀察球囊損傷術(shù)前、術(shù)后即刻和4周后腹主動(dòng)脈局部的血流頻譜發(fā)現(xiàn)，PSV在術(shù)后即刻出現(xiàn)明顯升高，4周后明顯下降，而EDV和Vmean在術(shù)后即出現(xiàn)明顯下降，4周后進(jìn)一步降低。以上均說(shuō)明球囊損傷術(shù)后血管局部的收縮和舒張功能受損，甚至出現(xiàn)血管再狹窄。持續(xù)給予ANG-（1-7）4周，可以明顯提高EDV，而ANG-（1-7）特異性受體拮抗劑可抵消部分ANG-（1-7）的作用，這說(shuō)明ANG-（1-7）在一定程度上具有改善球囊損傷所致的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能下降。

盡管PSV和EDV可以預(yù)測(cè)心腦血管事件的作用，但它們被認(rèn)為在超聲檢查中受較多因素影響，如探測(cè)技術(shù)和生理狀態(tài)等，具有較大可變性。本研究采用的超聲探頭為固定在血管表面，具有角度較為恒定的優(yōu)點(diǎn)，受探測(cè)技術(shù)影響較小，結(jié)果更為可靠。當(dāng)然，RI和PI能更穩(wěn)定反映血管阻力和順應(yīng)性，受影響因素較小，和動(dòng)脈硬化程度相關(guān)[13]。Lee等人發(fā)現(xiàn)頸動(dòng)脈的RI可用于高血壓患者進(jìn)行患冠心病的危險(xiǎn)分層[14]。另外，PI增高被發(fā)現(xiàn)與血管彌漫性病變獨(dú)立相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)ANG-（1-7）可降低球囊損傷術(shù)后PI和RI的值，一方面進(jìn)一步說(shuō)明ANG-（1-7）可減輕血管損傷后的血管阻力升高，改善血管舒張功能，另一方面可能從側(cè)面反映ANG-（1-7）對(duì)動(dòng)脈硬化或血管狹窄有保護(hù)作用。