汪 矗 李 科 石少卿 李 敏

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其中約85%是非小細胞肺癌(NSCLC)[1]。NSCLC常診斷在患癌晚期，且患者的5年總生存率非常低[2]。癌細胞的葡萄糖代謝方式主要依靠糖酵解而不是三羧酸循環(huán)，由于癌細胞的快速生長會消耗大量的葡萄糖[3-5]，因此機體會通過糖酵解的逆反應(yīng)-糖異生途徑為癌細胞不斷地提供葡萄糖。

CRTC2是CREB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的共激活因子，能夠促進肝臟的糖異生反應(yīng)[6-7]。Shi等[8]發(fā)現(xiàn)CRTC2能夠促進肺癌細胞A549的體外遷移和增殖能力。Li等[9]發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌患者的CRTC2及其突變后的蛋白表達水平明顯高于正常人群。

本研究發(fā)現(xiàn)CRTC2在非小細胞肺癌患者癌組織中的表達水平明顯高于癌旁，且與糖異生關(guān)鍵酶G6Pase和PEPCK的表達顯著正相關(guān)，能夠增加NSCLC大鼠的血糖水平、促進糖異生反應(yīng)并減少細胞凋亡。進一步的機制驗證發(fā)現(xiàn)miR-451是參與CRTC2促糖異生發(fā)生的關(guān)鍵因子，CRTC2通過CREB結(jié)合在miR-451的啟動子區(qū)并抑制miR-451的轉(zhuǎn)錄活性，提高miR-451靶基因Gyk及其下游G6Pase和PEPCK的表達水平，從而促進NSCLC的糖異生途徑，這為NSCLC的發(fā)生提供新的理論依據(jù)和作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

20只非小細胞肺癌大鼠模型購自廣州賽業(yè)生物公司；葡萄糖、丙酮酸和胰島素購自美國sigma公司；CRTC2蛋白、參與糖異生途徑的G6Pase 、PEPCK和Gyk蛋白及內(nèi)參β-actin抗體均購自美國Abcam公司；干擾CRTC2的慢病毒載體、miR-451 mimic、miR-451 inhibitor及pcDNA3.1-CRTC2質(zhì)粒均購自上海吉瑪公司；Tunel凋亡試劑盒、RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光素酶活性檢測試劑盒均購自美國promega公司。染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒購自美國milippore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)本采集 選取本院2015年至2018年收治住院的70例非小細胞肺癌患者，其中男性42例、女性28例；年齡40～70歲，中位年齡57歲；肺鱗癌30例、肺腺癌32例、腺鱗混合癌8例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)和細胞學(xué)證實為非小細胞肺癌；肝腎功能、血象正常。

1.2.2 非小細胞肺癌大鼠的處理 將0.2 ml滴度為1×109的陰性對照(sh-Ctr)、干擾CRTC2(sh-CRTC2)慢病毒載體及miR-451抑制劑通過尾靜脈注射至非小細胞肺癌大鼠，注射后第五天檢測糖異生途徑相關(guān)指標(biāo)變化。

1.2.3 葡萄糖代謝檢測 葡萄糖代謝檢測包括葡萄糖耐量實驗(GTT)、丙酮酸耐受實驗(PTT)和胰島素耐受實驗(ITT)。對于GTT和PTT實驗，大鼠禁食6小時后腹腔注射2 g/kg體重的葡萄糖和丙酮酸；對于ITT實驗，大鼠禁食4 h后腹腔注射1單位/kg體重的胰島素，采用血糖測量儀檢測大鼠的血糖濃度。

1.2.4 實時定量PCR檢測 采用貼壁細胞RNA提取試劑盒提取非小細胞肺癌細胞株A549的總RNA。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，熒光定量PCR檢測CRTC2、miR-451、G6Pase、PEPCK和Gyk的表達水平。各檢測基因的QPCR引物見表1。QPCR結(jié)果采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.2.5 western blot檢測 向A549細胞中加入RIpA蛋白裂解液，至4 ℃離心機以12 000 rpm離心10 min，吸取上清加入4倍體積的SDS loading buffer，混勻后放入100 ℃水浴5 min。 取30 μg的蛋白裂解液加入8% SDS-PAGE凝膠中分別以60 V和100 V電壓進行蛋白濃縮和分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜，以10%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入兔抗大鼠CRTC2、G6Pase、PEPCK和Gyk抗體，4 ℃過夜孵育后，ECL發(fā)光液顯色。

1.2.6 miR-451 mimic及pcDNA3.1-CRTC2轉(zhuǎn)染A549細胞 A549細胞接種至6孔板，當(dāng)細胞密度達到80%,每孔轉(zhuǎn)染5微升的miR-451 mimic和陰性對照NC，轉(zhuǎn)染24 h后，再轉(zhuǎn)染入1 μg的pcDNA3.1-CRTC2質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后，檢測A549細胞中CRTC2、miR-451、G6Pase、PEPCK和Gyk糖異生途徑相關(guān)指標(biāo)的變化。

表1 QPCR檢測引物

1.2.7 TUNEL染色檢測A549細胞凋亡 A549細胞經(jīng)miR-451 mimic和pcDNA3.1-CRTC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，采用4%多聚甲醛固定。再利用TUNEL試劑盒檢測A549細胞的凋亡個數(shù)，定量結(jié)果采用TUNEL陽性細胞核占總細胞核的百分比表示。

1.2.8 熒光素酶報告載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 采用MEME在線預(yù)測miR-451啟動子上游2000 bp的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)-1121 bp處存在CREB的結(jié)合位點。從人基因組中釣取miR-451啟動子片段，并構(gòu)建入pGL3-basic載體中。帶酶切位點的引物為Kpn I-miR-451-F：GGTACCTTTAGCTGAAACCGTTGA，Nhe I-miR-451-R：GCTAGCGTAGCGTTGTGATGGATC，構(gòu)建成功后提取質(zhì)粒，命名為pGL3-Wt。miR-451啟動子上CREB位點的缺失突變由上海生工公司合成，采用DNA合成技術(shù)合成不含有CREB結(jié)合位點的miR-451啟動子，并將此序列克隆至pGL3-basic載體，命名為pGL3-Mut。實驗組將pGL3-Wt或pGL3-Mut與pRL-TK載體共轉(zhuǎn)染入A549細胞中，對照組轉(zhuǎn)染pGL3-basic與pRL-TK，每孔轉(zhuǎn)染劑量為2 μg。轉(zhuǎn)染24 h后，裂解細胞并采用promega熒光素酶分析儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，兩者比值為熒光素酶的相對活性。

1.2.9 染色質(zhì)免疫共沉淀 取出生長至90%以上的細胞，加入37%多聚甲醛，室溫交聯(lián)10 min后，加入甘氨酸終止交聯(lián)。將細胞培養(yǎng)基吸出，加入預(yù)冷的PBS潤洗兩次后，將細胞刮下并4 ℃下以2 000 rpm離2 min，收集細胞沉淀加入SDS Lysis Buffer后進行超聲破碎。將超聲后的細胞分為3組：input組、IgG陰性對照組和加anti-CRTC2抗體組。4 ℃過夜孵育后，于每組加入proteinA磁珠，孵育2 h后洗滌沉淀復(fù)合物。將洗滌后的DNA片段用于QPCR分析，設(shè)計miR-451啟動子-1121位點的QPCR引物，上游：5'-AGCATGTAGACTGCTGGGGCAA-3'；下游：5'-CCTGCAGTAGGTTTCTGCTGCCTTG-3'。以input為內(nèi)參，結(jié)果采用2-△△Ct法計算相對值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpadprism 6.05軟件統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)，單因素方差分析One-Way ANOVA和Student'st檢驗進行差異比較分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRTC2、miR-451及糖異生途徑關(guān)鍵酶在非小細胞肺癌患者中的表達水平

CRTC2、G6Pase和PEPCK在NSCLC患者腫瘤組織中的表達水平明顯高于癌旁(P<0.01)，與之相反，miR-451在NSCLC患者腫瘤組織中的表達水平明顯低于癌旁(P<0.01)。pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)70例NSCLC患者的CRTC2與G6Pase和PEPCK的表達水平呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.4815和0.2723；CRTC2與miR-451的表達水平則呈顯著負相關(guān)(P<0.01，γ=-0.608)。以上結(jié)果表明，糖異生途徑可能影響NSCLC的發(fā)生，CRTC2表達水平與糖異生關(guān)鍵酶G6Pase、PEPCK及miR-451存在明顯關(guān)聯(lián)。

2.2 CRTC2通過抑制miR-451表達影響NSCLC大鼠的葡萄糖代謝

設(shè)計和構(gòu)建干擾CRTC2的慢病毒載體sh-CRTC2和miR-451 抑制劑，并通過尾靜脈注射NSCLC大鼠和葡萄糖耐量實驗(GTT)、丙酮酸耐受實驗(PTT)、胰島素耐受實驗(ITT)檢測CRTC2和miR-451是否參與NSCLC大鼠的葡萄糖代謝。如圖1A-1C所示，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)三段CRTC2干擾片段中，sh-CRTC2-2的干擾效果最佳，且干擾CRTC2導(dǎo)致miR-451的表達水平顯著升高，而糖異生途徑關(guān)鍵酶G6Pase和PEPCK的表達明顯降低；注射miR-451 inhibitor挽救了被sh-CRTC2抑制的G6Pase和PEPCK表達水平，提示CRTC2上調(diào)糖異生途徑關(guān)鍵基因G6Pase和PEPCK的表達可能是通過抑制miR-451。與sh-Ctr對照組相比，干擾CRTC2導(dǎo)致NSCLC大鼠飼喂?fàn)顟B(tài)和空腹?fàn)顟B(tài)下的血糖水平顯著下降，而miR-451 inhibitor的注射緩解了血糖的下降程度，見圖1D。PTT實驗表明sh-CRTC2的NSCLC大鼠新生肝糖原水平低于sh-Ctr組，而miR-451 inhibitor使肝糖原生成水平明顯上升；ITT實驗顯示干擾CRTC2的表達導(dǎo)致血糖水平降低，而注射miR-451 inhibitor緩解了血糖下降趨勢，提示NSCLC大鼠對胰島素的敏感性與CRTC2和miR-451的表達有關(guān)，兩者分別發(fā)揮著促進和抑制的作用；GTT實驗表明干擾CRTC2導(dǎo)致外源葡萄糖的消耗更加迅速，明顯快于sh-Ctr組大鼠，因此導(dǎo)致血糖水平降低的更快，注射miR-451 inhibitor挽救了血糖水平的降低趨勢，使其回升的血糖水平明顯高于sh-CRTC2組，見圖1E-1G。

注：圖1A-1B表示CRTC2三段干擾序列在NSCLC肺癌組織中的干擾效果；圖1C表示CRTC2和miR-451 inhibitor對G6Pase和PEPCK RNA水平的影響；圖1D表示空腹和喂食狀態(tài)的NSCLC大鼠的血糖水平受到CRTC2干擾和miR-451 inhibitor的影響；圖1E-1G分別表示CRTC2干擾和miR-451 inhibitor影響PTT、ITT和GTT實驗下的NSCLC大鼠血糖水平。

2.3 CRTC2/miR-451軸通過促進糖異生途徑抑制細胞凋亡

本研究采用Tunel凋亡實驗檢測NSCLC細胞A549在經(jīng)受miR-451 mimic和pcDNA3.1-CRTC2轉(zhuǎn)染后的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比NC對照轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染miR-451 mimic促進A549細胞的凋亡，而Gyk、PERCK和G6Pase的表達受到抑制；在轉(zhuǎn)染miR-451 mimic的基礎(chǔ)上再次轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CRTC2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單獨轉(zhuǎn)染miR-451 mimic相比，A549的細胞凋亡個數(shù)減少，且受miR-451抑制的Gyk、PERCK和G6Pase表達水平明顯回升，見圖2A-2D，以上結(jié)果證明miR-451能夠抑制糖異生途徑并促進細胞凋亡，而CRTC2減弱了miR-451對糖異生的抑制作用，及其引起的A549細胞凋亡。

A和B表示A549細胞凋亡實驗的檢測結(jié)果；C和D表示western blot和QPCR檢測miR-451 mimic和pcDNA3.1-CRTC2轉(zhuǎn)染的A549細胞中miR-451靶基因Gyk及下游PERCK和G6Pase的表達水平。

2.4 CRTC2抑制miR-451的分子機制

我們采用hTTP://meme-suite.org/數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測miR-451上游2 000 bp啟動子序列，發(fā)現(xiàn)-1121 bp處存在CREB的結(jié)合序列。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗發(fā)現(xiàn)，干擾CRTC2導(dǎo)致CREB與miR-451啟動子-1121 bp處的結(jié)合能力明顯下降，見圖3。將大小為2000 bp的miR-451啟動子克隆至pGL3-basic載體，重組載體命名為pGL3-Wt，CREB位點缺失突變的miR-451啟動子重組載體命名為pGL3-Mut。熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示pGL3-Mut的雙熒光素酶活性明顯高于pGL3-Wt，而干擾CRTC2導(dǎo)致pGL3-Wt和pGL3-Mut的雙熒光素酶活性明顯高于sh-Ctr對照組，表明miR-451啟動子-1121 bp處的CREB結(jié)合序列是CRTC2抑制miR-451轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵位點，突變此位點序列或干擾CRTC2都能夠增強miR-451啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。

3 討論

腫瘤細胞的代謝重編程，被認為是癌癥發(fā)生的標(biāo)志之一，在過去的十年中，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的代謝途徑逐漸被報道，如戊糖磷酸途徑、絲氨酸甘氨酸途徑和糖酵解途徑[10-12]，但與糖酵解相逆的糖異生途徑卻鮮有報道。糖異生途徑是機體中的非碳水化合物碳源如乳酸、丙酮酸、氨基酸及甘油等物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樘?葡萄糖或糖原)的過程，在空腹或饑餓狀態(tài)下，機體主要依靠糖異生途徑維持正常血糖濃度。這致使糖酵解或糖異生反應(yīng)會不可避免地造成細胞的代謝壓力，進而導(dǎo)致癌細胞的代謝重編程受損[13-16]。因此，糖酵解或糖異生途徑作為代謝重編程的治療靶點對癌細胞的生長和生存至關(guān)重要。

A表示ChIP實驗驗證-1121位置的結(jié)合位點與CRTC2和CREB轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的結(jié)合能力；B表示熒光素酶實驗驗證干擾CRTC2對miR-451野生型及突變型的啟動子活性的影響。

CRTC2作為人體血糖調(diào)節(jié)的開關(guān)性蛋白，在正常情況下，以磷酸化形式存在于細胞質(zhì)中，當(dāng)接收活化信號，CRTC2迅速去磷酸化并轉(zhuǎn)位至細胞核中與CREB蛋白形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，激活糖異生關(guān)鍵酶G6Pase、PEPCK的表達，從而調(diào)節(jié)糖異生途徑。CRTC2與癌癥發(fā)生的相關(guān)報道較少，F(xiàn)ang等[17]的研究發(fā)現(xiàn)CRTC2是淋巴瘤抑制因子，能通過轉(zhuǎn)錄DNA得錯配修復(fù)來保持基因組的完整性；Brown等[18]發(fā)現(xiàn)CRTC2通過調(diào)節(jié)芳香化酶，影響更年期和肥胖相關(guān)得荷爾蒙環(huán)境，并在肥胖和乳腺癌之間建立聯(lián)系。此外，Li等發(fā)現(xiàn)CRTC2及其突變體在非小細胞肺癌組織中的表達水平高于癌旁組織。以上報道提示CRTC2作為調(diào)節(jié)糖異生途徑的關(guān)鍵因子亦可能參與癌癥的發(fā)生。本研究通過對70例非小細胞肺癌患者癌和癌旁組織的定量分析，發(fā)現(xiàn)CRTC2在NSCLC癌組織中的表達明顯高于高旁，這與Li的報道一致。不僅如此，CRTC2與糖異生關(guān)鍵酶G6Pase和PEPCK的在腫瘤組織中的表達均高于癌旁，且與CRTC2呈顯著正相關(guān)，表明CRTC2在非小細胞肺癌腫瘤組織中的表達水平可能影響糖異生途徑。

腫瘤細胞中的miR-451處于失調(diào)狀態(tài)，能通過靶向抑制多個分子發(fā)揮促癌或抑癌的作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-451在非小細胞肺癌組織中的表達降低，而上調(diào)miR-451能夠增強非小細胞肺癌對放療和順鉑化療的敏感性[19-20]，表明miR-451對NSCLC的發(fā)展發(fā)揮著抑制作用。而在高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠和肥胖小鼠肝臟中，miR-451表達上升，表明其參與肝臟的代謝紊亂[21-22]。Shu等[23]發(fā)現(xiàn)miR-451是糖異生反應(yīng)的上游抑制因子，能夠靶向抑制Gyk的表達從而進一步阻遏AKT-FOXO1-PEPCK/G6Pase 通路。本研究發(fā)現(xiàn)miR-451在NSCLC癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且與CRTC2的表達呈顯著負相關(guān)，推測miR-451可能與CRTC2共同參與NSCLC的發(fā)生。為證實此猜想，進一步的研究利用干擾CRTC2的慢病毒載體和miR-451抑制劑通過尾靜脈注射至NSCLC大鼠模型中，通過QPCR和葡萄糖耐量實驗(GTT)、丙酮酸耐受實驗(PTT)和胰島素耐受實驗(ITT)證實缺乏CRTC2導(dǎo)致miR-451表達上升，且降低空腹和飽腹?fàn)顟B(tài)下NSCLC大鼠的血糖水平，而miR-451 inhibitor在降低miR-451表達的同時，亦挽回了CRTC2缺陷大鼠的血糖下降趨勢，使其血糖水平高于僅注射sh-CRTC2的NSCLC大鼠，表明CRTC2/miR-451軸具有穩(wěn)定NSCLC大鼠血糖水平的功能。

已有的研究證實敲除肺癌細胞中的PERCK能夠增強葡萄糖耗竭誘導(dǎo)的細胞凋亡，miR-451能夠靶向調(diào)節(jié)Gyk控制PERCK的表達[23]，提示miR-451不僅能夠抑制糖異生途徑，還能通過下調(diào)PERCK引起細胞凋亡。為證實CRTC2通過糖異生途徑影響非小細胞肺癌發(fā)生的進程，本研究通過向A549細胞轉(zhuǎn)染miR-451 mimic、過表達CRTC2(pcDNA3.1-CRTC2)的載體以及細胞凋亡實驗，發(fā)現(xiàn)miR-mimic導(dǎo)致A549凋亡細胞增加，而lv-CRTC2則抑制了miR-mimic的促凋亡作用。進一步，通過western blot和QPCR發(fā)現(xiàn)CRTC2阻遏了miR-451對Gyk的靶向抑制，表現(xiàn)為Gyk及其下游的G6Pase和PEPCK表達升高，由于PEKCK參與葡萄糖消耗引起的細胞凋亡，因此本研究結(jié)果表明CRTC2通過抑制miR-451的表達促進糖異生途徑，并參與NSCLC細胞的凋亡抑制。

CRTC2作為CREB的共激活因子共同參與調(diào)節(jié)細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和糖異生途徑[24]。本研究采用在線分析hTTP://meme-suite.org/預(yù)測miR-451上游啟動子的-1121bp處存在CREB的結(jié)合序列。進一步，將miR-451啟動子及其CREB位點突變序列克隆至熒光素酶報告載體，并采用ChIP檢測CRTC2與CREB的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與-1121bp位點的結(jié)合能力和miR-451啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾CRTC2明顯阻遏了其與miR-451啟動子的結(jié)合能力，并導(dǎo)致啟動子的轉(zhuǎn)錄活性升高，表明-1121bp位點對miR-451啟動子的抑制作用；進一步的點突變實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型的miR-451啟動子活性明顯低于突變型，而在CRTC2干擾的A549細胞中，突變型啟動子的活性升高的更為明顯，表明-1121bp處的CREB結(jié)合序列是抑制miR-451啟動子活性的關(guān)鍵位點，CRTC2通過此位點抑制miR-451的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)其在NSCLC細胞中的表達。

綜上所述，CRTC2是參與非小細胞肺癌糖異生反應(yīng)的上游關(guān)鍵因子，通過轉(zhuǎn)錄抑制miR-451，增強miR-451下游Gyk、G6Pase和PEPCK的表達，并進一步減少NSCLC細胞的凋亡，這為NSCLC的發(fā)生提供新的理論依據(jù)和作用機制。