馬旭蘭 夏 迪 王慧霄 蔣子雯 代蔭梅

(首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科，北京 100026)

子宮內(nèi)膜癌是來源于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，近年來發(fā)病率在世界范圍內(nèi)明顯上升，嚴重危害女性健康[1]。子宮內(nèi)膜癌的病理類型分為雌激素依賴型(Ⅰ型，占80%)和雌激素非依賴型(Ⅱ型)，無孕激素拮抗的高雌激素長期刺激與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生密切相關(guān)[2]，但雌激素在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的確切作用機制目前尚未闡明。Huang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA HOTAIR在子宮內(nèi)膜癌組織中存在高表達，與腫瘤分期、肌層浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)；敲減HOTAIR表達可抑制子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞的增生、侵襲和遷移等惡性生物學行為進展，本課題組前期在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中也得到一致結(jié)論[4]。因此，本研究通過細胞及動物實驗從基因水平探究雌激素是否通過介導HOTAIR表達對子宮內(nèi)膜癌細胞增生及裸鼠致瘤能力產(chǎn)生影響，以期為子宮內(nèi)膜癌的臨床治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

高分化人子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa(雌激素受體陽性)為本實驗室保存；RPMI-1640培養(yǎng)基(酚紅+/-)和胎牛血清購自美國Gibco公司；碳吸附特級胎牛血清購自以色列BI公司；干擾慢病毒及引物合成購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Prime Script反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq購自美國Promega公司；雌二醇(17β-estradiol，E2)購自美國Sigma公司；E2緩釋片(60 d緩釋、0.72 mg/片)購自美國IRA公司；BALB/c-nu裸鼠28只(3～4周齡，雌性，SPF級)購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2011-0012。本動物實驗已通過首都醫(yī)科大學動物福利協(xié)會倫理審查，倫理編號：AEEI-2018-196，于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所完成實驗。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理

Ishikawa細胞用含10%(體積分數(shù))胎牛血清、100 U/L青霉素和100 U/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1～2 d更換新鮮培養(yǎng)基，當細胞融合度達到80%～90%時進行傳代。用E2(10 nmol/L)處理細胞4 h后提取總RNA進行后續(xù)實驗。實驗細胞分為4組：對照組(Ishikawa細胞)、E2組(E2+Ishikawa細胞)、E2+shNC組(E2+shNC細胞)、E2+shHOTAIR組(E2+shHOTAIR細胞)。進行雌激素實驗前需更換含10%(體積分數(shù))碳吸附胎牛血清的無酚紅RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)至少3 d以耗竭細胞中的雌激素。

1.3 構(gòu)建慢病毒介導干擾HOTAIR表達的shHOTAIR及陰性對照shNC穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株

設(shè)計3條HOTAIR低表達的干擾序列:shHOTAIR-2379(5′-CCGGGAACGGGAGTACAGAGAGAAT CTCGAGATTCTCTCTGTACTCCCGTTCTTTTTTG-3′)、shHOTAIR-2380(5′-CCGGGCAGCACAGAGCAACTCTATACTCGAGTATAGAGTTGCTCTGTGCTGCTTTTTTG-3′)、shHOTAIR-2381(5′-CCGGGGACTGGGAGGCGCTA ATTAACTCGAGTTAATTAGCGCCTCCCAGTCCTTT TTTG-3′)及陰性對照shNC序列進行慢病毒包裝(包裝后表達綠色熒光蛋白及嘌呤霉素抗性)，經(jīng)測序證實構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的干擾慢病毒分別感染Ishikawa細胞，用含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選感染成功的細胞，并于熒光顯微鏡下篩選表達綠色熒光大于90%的細胞株，qRT-PCR檢測shHOTAIR細胞株中HOTAIR的干擾效率，選擇干擾效果最好的細胞株進行后續(xù)細胞及動物實驗。

1.4 qRT-PCR實驗

提取各組細胞總RNA，根據(jù)試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，各基因反應(yīng)條件按試劑盒說明書操作，進行qRT-PCR。計算△Ct，以2-△△Ct表示目的基因的相對表達量。HOTAIR引物：F1(5′-GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC-3′)、R1(5′-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3′)；內(nèi)參基因GAPDH引物：F2(5′-GCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3′)、R2(5′-GCCAGGGGTGCTAAGCAG-3′)。

1.5 裸鼠成瘤實驗

本實驗將28只BALB/c-nu裸鼠采用數(shù)字表法隨機平均分為4組：對照組(接種Ishikawa細胞)、E2組(接種E2+Ishikawa細胞)、E2+shNC組(接種E2+shNC細胞)、E2+shHOTAIR組(接種E2+shHOTAIR細胞)，每組7只，組內(nèi)各裸鼠進行打耳孔標記。飼養(yǎng)1周后，對28只裸鼠進行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。待裸鼠狀態(tài)恢復后，對需E2處理的3組裸鼠頸部皮下植入E2緩釋劑。于各裸鼠右側(cè)背部皮下對應(yīng)接種處于對數(shù)生長期的4組細胞，每只裸鼠接種細胞量為5×106個/100 μL。接種細胞后每3日監(jiān)測裸鼠生長情況及稱質(zhì)量，記錄每只裸鼠的成瘤時間，計算成瘤率。細胞成瘤后開始監(jiān)測移植瘤生長情況，測量移植瘤的長徑a及短徑b計算移植瘤體積并繪制生長曲線(移植瘤體積V=a×b2/2)。于接種第28天(移植瘤體積達到500 mm3時)終止實驗，全身麻醉后頸椎脫位法處死裸鼠，完整剝離腫瘤，測量質(zhì)量及長短徑并拍照記錄。

1.6 移植瘤組織病理學檢測

將剝離的四組移植瘤各取部分于10%(體積分數(shù))甲醛溶液固定、石蠟包埋、病理切片，進行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，鏡下(200×、400×)觀察移植瘤的病理形態(tài)改變。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建慢病毒介導干擾HOTAIR表達的shHOTAIR及陰性對照shNC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株

已成功包裝HOTAIR低表達的3組慢病毒shHOTAIR-2379、shHOTAIR-2380、shHOTAIR-2381及陰性對照慢病毒shNC，經(jīng)測序證實構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的慢病毒轉(zhuǎn)染至Ishikawa細胞，成功構(gòu)建相應(yīng)4株穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞，qRT-PCR結(jié)果顯示(圖1)：shHOTAIR-2379細胞株中HOTAIR相對表達量(0.340±0.048)是shNC細胞株(0.931±0.032)的0.365倍(P<0.001)；shHOTAIR-2380細胞株中HOTAIR相對表達量(0.325±0.041)是shNC細胞株的0.349倍(P<0.001)；shHOTAIR-2381細胞株中HOTAIR相對表達量(0.379±0.034)是shNC細胞株的0.407倍(P<0.001)。由此可見，shHOTAIR穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中HOTAIR表達水平均明顯低于shNC細胞株，差異均有統(tǒng)計學意義。慢病毒介導的shHOTAIR細胞株中HOTAIR表達敲減有效，shHOTAIR-2380細胞株敲減效果最好。

圖1 qRT-PCR法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株shHOTAIR及shNC中HOTAIR的表達Fig.1 Expression of HOTAIR in stable transfected cell lines shHOTAIR and shNC was detected by qRT-PCR

2.2 qRT-PCR法檢測E2對HOTAIR表達不同的4組Ishikawa細胞中HOTAIR表達的影響

qRT-PCR法檢測4組細胞中HOTAIR的相對表達量發(fā)現(xiàn)(圖2)：E2組(2.084±0.052)HOTAIR的相對表達量明顯高于對照組(1.000±0.046)，約其2.084倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；E2+shHOTAIR組(0.930±0.013)HOTAIR的相對表達量明顯低于E2+shNC組(1.980±0.064)，約其0.470倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

圖2 qRT-PCR法檢測E2對HOTAIR表達不同的4組Ishikawa細胞中HOTAIR表達的影響Fig.2 Effect of E2 on the expression of HOTAIR in four groups of Ishikawa cells with different HOTAIR expression by qRT-PCR

2.3 成功構(gòu)建E2作用于HOTAIR表達不同的4組Ishikawa細胞的裸鼠移植瘤模型

各組荷瘤裸鼠及相應(yīng)移植瘤對比如下(圖3A、B)，本實驗成功構(gòu)建了雌激素E2作用于HOTAIR表達不同的4組Ishikawa細胞的裸鼠移植瘤模型。

2.4 E2對HOTAIR表達不同的4組Ishikawa細胞裸鼠致瘤能力的影響

E2組和E2+shNC組裸鼠于接種細胞第8天時全部成瘤，成瘤率均為100%；對照組裸鼠第8天時只有5只成瘤，余下2只終未成瘤，成瘤率為71.4%；E2+shHOTAIR組裸鼠于第8天時僅有2只成瘤，第11天時增加至5只，余下2只終未成瘤，成瘤率為71.4%(表1)。其中，E2組于接種細胞第15天時死亡一只荷瘤裸鼠，剩余6只。通過對以上成瘤率的比較發(fā)現(xiàn)，各組差異尚無統(tǒng)計學意義。裸鼠成瘤后通過測量并計算移植瘤體積，繪制移植瘤生長曲線(圖3 C)，發(fā)現(xiàn)在裸鼠接種細胞第26日及第28日，移植瘤體積對比：E2組>對照組，E2+shNC組>E2+shHOTAIR組，差異有統(tǒng)計學意義。綜合比較4組裸鼠成瘤時間、成瘤率及生長曲線可得，裸鼠致瘤能力對比：E2組>對照組，E2+shNC組>E2+shHOTAIR組。

表1 4組裸鼠成瘤時間和成瘤率的比較Tab.1 Comparison of tumor formation time and tumor formation rate in four groups of nude mice

2.5 E2對HOTAIR表達不同的4組Ishikawa細胞裸鼠移植瘤終體積及終質(zhì)量的影響

處死各組裸鼠后，剝離移植瘤，測量長短徑及稱質(zhì)量，根據(jù)公式計算4組移植瘤終體積對比發(fā)現(xiàn)(圖4A)：E2組移植瘤的平均體積(488.936±130.021)mm3明顯高于對照組(251.975±63.767)mm3，約1.940倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；E2+shHOTAIR組移植瘤的平均體積(130.517±22.273)mm3明顯低于E2+shNC組(335.271±70.768)mm3，約0.389倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。同時，4組移植瘤的終質(zhì)量對比發(fā)現(xiàn)(圖4B)：E2組移植瘤的平均質(zhì)量(0.377±0.035)g，明顯高于對照組(0.221±0.034) g，約1.706倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；E2+shHOTAIR組移植瘤的平均質(zhì)量(0.130±0.031)g，明顯低于E2+shNC組(0.328±0.018)g，約0.396倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

圖4 E2對HOTAIR表達不同的4組Ishikawa細胞裸鼠移植瘤終體積(A)及終質(zhì)量(B)的影響Fig.4 Effects of E2 on the final volume (A) and the final weight (B) of xenograft tumors in four groups nude mice with different expression of HOTAIR

2.6 裸鼠移植瘤組織病理學檢測

4組裸鼠移植瘤組織切片HE染色，鏡下(200×、400×)觀察移植瘤的病理形態(tài)改變發(fā)現(xiàn)(圖5)，組織內(nèi)細胞量大，異形明顯，核大、深染、不規(guī)則，病理核分裂活躍，并可見局部細胞出現(xiàn)空泡變性及壞死灶，符合子宮內(nèi)膜癌細胞特征。

圖5 4組裸鼠移植瘤HE染色Fig.5 HE staining of xenograft tumors in four groups nude mice

3 討論

在人類基因組中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)編碼基因僅占比2%，高達90%的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為非編碼RNA[5]。長鏈非編碼RNA可在表觀遺傳學、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平等多層面廣泛參與基因組的表達調(diào)控過程[6]。其中，HOTAIR是首個被發(fā)現(xiàn)的反義轉(zhuǎn)錄的長鏈非編碼RNA，位于第12號染色體的HOXD基因座上，長度為2.2 kb[7]。研究顯示，HOTAIR在子宮內(nèi)膜癌[3]、乳腺癌[8]、宮頸癌[9]和肝細胞癌等[10]多種腫瘤及椎間盤退變[11]、軟骨損傷[12]等多種非腫瘤疾病中均存在高表達水平，且與疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。HOTAIR的經(jīng)典作用機制是發(fā)揮支架作用，招募PRC2和LSD1復合體并與之結(jié)合，定位至特定位點，導致相關(guān)抑癌基因甲基化而發(fā)生表觀遺傳學沉默，從而促進疾病的發(fā)生發(fā)展[13]。此外，HOTAIR還可作為競爭性內(nèi)源RNA[14]、激活信號傳導通路[9]、參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]、調(diào)控自噬發(fā)生[16]及促進蛋白質(zhì)泛素化[17]等多種途徑促進疾病的進展。

近年來，關(guān)于HOTAIR在多種疾病中的作用機制已取得很大進展，但HOTAIR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的相關(guān)研究卻為數(shù)不多。Bhan等[18]發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在雌激素受體陽性的人乳腺癌MCF7細胞中轉(zhuǎn)錄受雌激素正向調(diào)控。該研究表明，HOTAIR的啟動子上含有雌激素受體反應(yīng)元件序列，而雌激素可以通過與雌激素受體結(jié)合形成二聚體，進而結(jié)合至HOTAIR啟動子上的雌激素反應(yīng)元件，從而誘導HOTAIR轉(zhuǎn)錄。同樣，子宮內(nèi)膜癌(Ⅰ型)起源于腺上皮，發(fā)病原因與雌激素密切相關(guān)，但雌激素促進子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的具體作用機制目前尚不明確。因此，本研究通過細胞和動物實驗兩部分進行探討雌激素是否通過介導HOTAIR表達對子宮內(nèi)膜癌細胞增生及裸鼠致瘤能力產(chǎn)生影響。

本研究采用慢病毒攜帶shHOTAIR干擾基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至Ishikawa細胞基因組的方法敲減HOTAIR表達水平[19]，使HOTAIR以敲減狀態(tài)在細胞中穩(wěn)定傳代，并通過qRT-PCR實驗證實shHOTAIR穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中HOTAIR表達水平被有效敲減。本研究在體外運用雌激素E2處理HOTAIR表達不同的4組細胞,qRT-PCR法檢測HOTAIR的表達水平，結(jié)果顯示雌激素可上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細胞中HOTAIR的表達，而抑制HOTAIR表達可抑制該效應(yīng)的發(fā)生。

本研究進一步選擇3～4周齡的先天性胸腺缺陷的BALB/c-nu裸鼠,自然殺傷細胞活性低，接種癌細胞易于成瘤[20]。待裸鼠適應(yīng)一周后對裸鼠進行雙側(cè)卵巢去勢切除手術(shù)建立了雌激素缺乏的絕經(jīng)裸鼠模型，符合子宮內(nèi)膜癌多發(fā)生于絕經(jīng)后女性的發(fā)病特點，也可排除雌性裸鼠內(nèi)源性雌激素的干擾，更好地觀察外源性雌激素對子宮內(nèi)膜癌細胞裸鼠成瘤的影響。之后本研究在接種細胞前進行裸鼠頸部皮下包埋雌激素緩釋劑，保證實驗裸鼠每日都能定量接受雌激素刺激，相對于皮下注射給藥方式[21]可以更好地模擬體內(nèi)雌激素釋放，藥效更穩(wěn)定，對裸鼠影響更小。接種細胞后8 d裸鼠出現(xiàn)肉眼可見的瘤結(jié)節(jié)，E2組和E2+shNC組7只全部成瘤，對照組只有5只成瘤，而E2+shHOTAIR組裸鼠在第8天時僅有2只成瘤，在第11天時，成瘤裸鼠增加至5只。對比4組裸鼠移植瘤生長曲線發(fā)現(xiàn)，在裸鼠接種細胞第26日及第28日，移植瘤體積E2組>對照組，E2+shNC>E2+shHOTAIR，差異有統(tǒng)計學意義。綜合比較4組裸鼠成瘤時間、成瘤率及生長曲線可得，雌激素可以促進子宮內(nèi)膜癌細胞的裸鼠致瘤能力，而抑制HOTAIR表達可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的裸鼠致瘤能力。E2組在接種細胞第15天時死亡一只荷瘤裸鼠，分析原因可能是裸鼠免疫系統(tǒng)差，而雌激素可以促進移植瘤生長，可能影響該鼠正常生理機能導致死亡。通過對4組裸鼠移植瘤生長曲線、終體積及終質(zhì)量對比發(fā)現(xiàn)，雌激素可促進子宮內(nèi)膜移植瘤細胞的增生能力，抑制HOTAIR表達可抑制雌激素的促瘤增生作用。動物實驗是從體內(nèi)實驗基礎(chǔ)上過渡到臨床應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)，本動物實驗成功構(gòu)建了雌激素E2作用于HOTAIR表達不同的4組Ishikawa細胞的裸鼠移植瘤模型，可為雌激素依賴性腫瘤的動物實驗?zāi)Ｐ蜆?gòu)建提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究通過體內(nèi)外實驗證明雌激素可通過上調(diào)HOTAIR表達促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增生及裸鼠致瘤能力。但腫瘤的發(fā)病機制異常復雜，雌激素調(diào)控HOTAIR促進子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的具體機制仍需進一步深入研究。明確雌激素調(diào)控HOTAIR作用于子宮內(nèi)膜癌的具體機制，可能為子宮內(nèi)膜癌患者提供新的治療靶點。