薛玲玲，馬會峰

河南科技大學第一附屬醫(yī)院1婦科，2產(chǎn)科，河南 洛陽 471000

子宮內膜癌（endometrial carinoma，EC）是臨床常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率較高，以圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性多見[1]。EC的發(fā)病部位較隱匿，早期癥狀不明顯，大部分患者確診時已為中晚期。手術治療能夠提高早期EC患者的遠期生存率，但其對于大部分中晚期EC患者特別是發(fā)生淋巴結轉移的中晚期EC患者的效果較差，患者復發(fā)率高，預后不良。因此，尋找EC的早期診斷和預后監(jiān)測指標是提高EC患者生存率的關鍵[2-3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度大于200個核苷酸且不編碼蛋白質的RNA片段，參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等多種生物學過程。H19屬于lncRNA，lncRNAH19在不同腫瘤中通過不同的途徑發(fā)揮著致癌基因或抑癌基因的作用。E2F轉錄因子1（E2F transcription factor 1，E2F1）是由人類E2F1基因編碼的蛋白質，是E2F轉錄因子家族中的重要成員，在多種惡性腫瘤中均過表達[4-5]。目前，關于H19與E2F1在EC患者EC組織中的表達情況及相關性的研究較少。本研究探討H19和E2F1在EC患者EC組織中的表達情況及臨床意義，旨在為EC的早期診治提供新的思路，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012年3月至2013年3月河南科技大學第一附屬醫(yī)院的64例EC患者。納入標準：①經(jīng)病理學檢查確診為原發(fā)子宮內膜癌；②術前未接受過放療及化療等抗腫瘤治療；③國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期[6]為Ⅰ～Ⅳ期；④依從性良好；⑤擬接受手術治療。排除標準：①年齡＜20歲；②近期服用過激素類藥物；③合并其他子宮疾??；④合并其他部位惡性腫瘤；⑤合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫系統(tǒng)疾?。虎藓喜乐氐男?、肺、腎等其他臟器功能障礙；⑦合并精神類疾病和認知功能障礙。64例EC患者的年齡為35～78歲，平均年齡為（54.36±4.18）歲；FIGO分期：Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期24例；分化程度：高分化17例，中分化35例，低分化12例；組織學分級：G1級31例，G2級20例，G3級13例；有淋巴結轉移21例，無淋巴結轉移43例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有研究對象及家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書。收集64例EC患者術中切除的EC組織及相應的癌旁組織石蠟標本，用無菌焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水洗去血液，置入去RNA酶離心管中，液氮中保存?zhèn)溆?。將所有樣品快速冷凍于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

Trizol試劑、實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）和反轉錄試劑盒均購自日本Takara公司，E2F1鼠抗人單克隆抗體、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）及免疫組化SP顯色試劑盒均由上?？泼羯锟萍加邢薰咎峁?。7500 FAST型qRT-PCR儀購自美國ABI公司，MyCycler PCR儀購自美國Bio-Rad公司，紫外分光光度計購自美國Thermo Fisher公司，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)購自英國Syngene公司。引物由上海Genepharma公司合成。

1.3 H19和E2F1相對表達量檢測

取50 mg組織樣本于液氮中研磨成粉末，迅速置于1.5 ml離心管中，加入100 ml Trizol試劑，嚴格按照試劑盒說明書的步驟從EC及癌旁組織中提取總RNA，采用紫外分光光度計檢測其濃度及純度，在260 nm和280 nm處測量吸光度值，計算兩者的比值，兩者比值為1.8～2.0方可用于合成cDNA。所有操作按照反轉錄試劑盒說明書進行。冰浴中配制20μl反應體系，包括5×Primer Script Buffer 4 μl，反應液10 μl，Primer Script RT Enzyme Mix 1 μl，RT Primer 2 μl，RNase-free ddH2O 3 μl。反應條件：95 ℃1 min，42 ℃15 min，85 ℃5 s；合成cDNA置于-20℃保持備用。PCR的總反應體系為20 μl，包括 2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μl，cDNA 2 μl，上游引物1.6 μl，下游引物1.6 μl，RNasefree ddH2O 4.8 μl。反應條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，65℃3 s，60℃30 s；共進行40個循環(huán)。以GAPDH為內參基因進行PCR擴增，采用2-△△Ct公式計算EC組織及癌旁組織中H19和E2F1的相對表達量。H19的上游引物為5'-TGATGACGGGTGGAGGGGCTA-3'，下游引物為5'-TGATGTCGCCCTGTCTGCACG-3'；E2F1的上游引物為5'-CTACGTGACGTGTCAGGACC-3'，下游引物為5'-GGTGGGGAAAGGCTGATGAA-3'；內參GAPDH的上游引物為5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游引物為5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。實驗重復3次。

1.4 E2F1蛋白檢測

采用免疫組化SP法檢測EC組織及癌旁組織中E2F1蛋白的表達情況，用已知EC組織陽性切片作陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。E2F1蛋白以細胞核呈棕黃色為陽性，根據(jù)陽性細胞所占比例和染色強度判斷染色結果。隨機選取高倍鏡（×200）下的10個不重復視野進行觀察，每個視野計數(shù)50個細胞，計算陽性細胞所占比例：無陽性細胞為0分，陽性細胞所占比例≤10%為1分，10%＜陽性細胞所占比例≤50%為2分，50%＜陽性細胞所占比例≤80%為3分，80%＜陽性細胞所占比例≤100%為4分。染色強度：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分。兩項評分相乘為總分，總分≤4分為E2F1蛋白表達陰性，總分＞4分為E2F1蛋白表達陽性。

1.5 隨訪

采用電話隨訪的方式對所有EC患者隨訪5年，每個月隨訪1次，隨訪截止時間為2018年3月31日，記錄隨訪期間患者的生存情況。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson法進行相關性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中H19和E2F1相對表達量的比較

qRT-PCR檢測結果顯示，H19在EC組織中的相對表達量為（2.91±0.73），明顯高于癌旁組織的（1.32±0.38），差異有統(tǒng)計學意義（t=18.360，P＜0.01）。E2F1在EC組織中的相對表達量為（1.73±0.49），明顯高于癌旁組織的（0.65±0.15），差異有統(tǒng)計學意義（t=15.810，P＜0.01）。

2.2 不同組織中E2F1蛋白陽性表達情況的比較

免疫組化SP法檢測結果顯示，E2F1蛋白在EC組織中的陽性表達率為67.19%（43/64），明顯高于癌旁組織的7.81%（5/64），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=48.133，P＜0.01）。（圖1）

圖1 免疫組化法檢測E2F1蛋白在EC 組織中的表達情況（SP染色，×200）

2.3 不同臨床特征EC患者EC組織中H19、E2F1表達情況的比較

以EC患者EC組織中H19相對表達量的中位數(shù)（2.31）、E2F1相對表達量的中位數(shù)（1.28）為臨界值，將64例EC患者分為H19高表達（H19相對表達量＞2.31）患者30例和H19低表達（H19相對表達量≤2.31）患者34例，E2F1高表達（E2F1相對表達量＞1.28）患者28例和E2F1低表達患者36例（E2F1相對表達量≤1.28）。不同年齡、分化程度、FIGO分期EC患者EC組織中H19的高表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同組織學分級、淋巴結轉移情況EC患者EC組織中H19的高表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=6.357、10.787，P＜0.05）。不同年齡EC患者EC組織中E2F1的高表達情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同F(xiàn)IGO分期、分化程度、組織學分級、淋巴結轉移情況EC患者EC組織中E2F1的高表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=5.486、7.156、7.591、17.578，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征EC患者EC組織中H19、E2F1的表達情況

2.4 EC組織中H19和E2F1表達的相關性分析

對EC患者EC組織中H19和E2F1表達的相關性進行Pearson相關性分析，結果顯示，H19和E2F1在EC患者EC組織中的表達呈正相關（r=0.750，P＜0.01）。

2.5 H19、E2F1表達與EC患者預后的關系

截至隨訪結束，64例EC患者中，生存31例，死亡33例。H19高表達的EC患者的5年生存率為33.33%（10/30），低于H19低表達的EC患者的61.76%（21/34），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.451，P=0.035）。E2F1高表達患者的5年生存率為32.14%（9/28），低于E2F1低表達患者的61.11%（22/36），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.432，P=0.020）。

3 討論

EC是女性生殖系統(tǒng)常見的三大惡性腫瘤之一，隨著人們生活水平的提高，其發(fā)病率逐漸上升，術后復發(fā)率升高，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢，嚴重威脅女性的健康與生命[7]。遺傳、絕經(jīng)情況、雌激素情況、病理學診斷和影像技術等多種因素與EC的發(fā)生、發(fā)展有關[8]。因此，需要對EC的致病機制進行深入的研究，以尋找新的預后標志物為EC患者提供最佳的治療和隨訪。

lncRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，主要在表觀遺傳學修飾、轉錄及轉錄后修飾方面調控基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在多種腫瘤中均有表達，能夠通過上調或下調其在腫瘤組織中的表達，調控下游靶基因的表達，從而發(fā)揮促癌基因或抑癌基因的作用，該類基因可作為腫瘤生物標志物[9]。多種lncRNA在EC的發(fā)生過程中均發(fā)揮著重要的作用，如HOX轉錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是個已知的、通過反式作用調節(jié)基因表達的lncRNA。王明娟等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在EC患者的EC組織中高表達，并與EC細胞的增殖、侵襲和遷移能力均有關。lncRNAANRIL是lncRNA的一種，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著致癌基因的作用。殷悅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ANRIL在EC患者的EC組織中的相對表達量較高，且與EC的病理分級可能有關，可作為早期EC的輔助診斷指標。H19是首個被發(fā)現(xiàn)與腫瘤有關的lncRNA，具有促進腫瘤生長和抑制腫瘤生長的雙重功能，在多種腫瘤尤其是在轉移性腫瘤中高表達，具有較強的致癌活性[12]。Zhu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)RNA干擾后的H19可抑制卵巢癌細胞的增殖和侵襲，促進卵巢癌細胞的凋亡，可能能夠作為卵巢癌治療的靶點。本研究結果顯示，H19在EC組織中的相對表達量明顯高于癌旁組織（P＜0.01），與Zhao等[14]的研究結果基本一致，提示H19在EC患者EC組織中的相對表達量較高，可能參與卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展。E2F1是細胞周期相關轉錄因子E2F家族成員之一，且具有多種功能，可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。王宏坤等[15]研究發(fā)現(xiàn)，E2F1在乳腺癌組織中的陽性表達率較高，可作為乳腺癌預后評估的指標。楊秀華和武昕[16]研究發(fā)現(xiàn)，E2F1在外陰鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率較高，不同腫瘤分期外陰鱗狀細胞癌患者外陰鱗狀細胞癌組織中E2F1的陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示E2F1可能參與外陰鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結果顯示，E2F1在EC組織中的相對表達量明顯高于癌旁組織（P＜0.01），與Mints等[17]的研究結果基本一致，提示EC患者組織中E2F1的表達上調。本研究進一步分析了H19和E2F1的表達與EC患者臨床特征的關系，結果顯示，H19的高表達情況與EC患者的年齡、分化程度、FIGO分期可能無關，與組織學分級、淋巴結轉移情況可能有關；E2F1的高表達情況與EC患者的年齡可能無關，與EC患者的FIGO分期、分化程度、組織學分級、淋巴結轉移情況可能有關，提示H19、E2F1參與EC的發(fā)生與發(fā)展。另外，本研究通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，EC患者EC組織中H19和E2F1的表達呈正相關（r=0.750，P＜0.01），提示二者可能通過相互協(xié)同作用參與EC的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，H19能夠通過競爭性結合miRNA-29a-3p調節(jié)E2F1的表達，而且E2F1能夠通過調控下游靶基因p53突變體參與EC的發(fā)生，因此，H19和E2F1可能存在共同的信號通路，在參與EC的發(fā)生與發(fā)展過程中起著一定的協(xié)同作用[18-19]。本研究結果還顯示，H19和E2F1低表達的EC患者的生存情況分別優(yōu)于H19和E2F1高表達的EC患者（P＜0.05），提示H19、E2F1的表達與EC患者的預后有關，可作為評估EC預后的指標之一。

綜上所述，H19和E2F1在EC患者EC組織中的表達上調，可能與EC患者的某些臨床特征有關，且二者的表達水平呈正相關；此外，H19和E2F1高表達患者的預后較差。因此，H19和E2F1可能成為EC發(fā)生和預后的潛在預測指標。但本研究的不足之處在于納入的樣本量不足，因此，在后續(xù)的研究中將進一步補充臨床資料、擴大樣本量，深入研究H19和E2F1在EC中的作用，以進一步闡明EC發(fā)生、發(fā)展的潛在分子機制。