周俊嶺，范彬，馬禮坤

（1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心血管內(nèi)科，安徽 合肥 230031；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，安徽 合肥 230041）

心肌纖維化（myocardial fibrosis,MF）是心肌組織中類成纖維細(xì)胞過度增殖，大量合成細(xì)胞外基質(zhì)的病理過程[1-2]。既往在脫氧皮質(zhì)酮（Deoxycorticosterone,DOC）/鹽誘導(dǎo)的大鼠MF 中觀察到顯著的炎癥反應(yīng)[2-3]。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的主要載體，有研究顯示MF 心肌組織中巨噬細(xì)胞浸潤明顯，但其如何聚集激活和極化較少報(bào)道[3-4]。當(dāng)前探討白細(xì)胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）對(duì)免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用已成為研究的熱點(diǎn)之一[5]。有研究表明IL-17 在MF中發(fā)揮重要作用，但是否對(duì)巨噬細(xì)胞有調(diào)控作用鮮有報(bào)道[6-7]。本研究通過復(fù)制DOC/鹽誘導(dǎo)的高血壓MF大鼠模型，觀察IL-17 對(duì)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)和心肌組織炎癥反應(yīng)的影響，探討IL-17 對(duì)巨噬細(xì)胞的極化作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

30 只雄性SD 大鼠（體重180 ～240 g）由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，清潔級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

DOC 購自美國Sigma 公司，注射用大豆油購自浙江田雨山大豆油開發(fā)有限公司，免疫組織化學(xué)SP 試劑盒、DAB 顯色劑及免疫印跡BCA 定量試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，CD206、CD11c、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）、精氨酸酶1（Arginase 1,Arg1）及內(nèi)參照（β-actin）一抗購自美國Millipore 公司，iNOS、Arg1 引物由上海生工生物工程有限公司合成（見表1）[8]，mRNA 提取試劑盒購自德國Qiagen 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及染料法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa 公司，ABI Step One Plus System RT-PCR 儀由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室提供。

表1 iNOS 和Arg1 的引物序列

1.3 高血壓MF 大鼠的模型復(fù)制

采用10%水合氯醛（400 mg/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉后實(shí)施右腎切除術(shù)，術(shù)后用含0.1%氯化鉀和1%氯化鈉的飲水灌胃2 周，隨機(jī)分成對(duì)照組、DOC組及DOC+IL-17 抗體組，每組10 只。對(duì)照組：大豆油皮下注射，1 次/4 d，生理鹽水腹腔注射，1 次/周；DOC 組：皮下注射DOC 60 mg/kg，1 次/4 d，生理鹽水腹腔注射，1 次/周；DOC+IL-17 抗體組：皮下注射DOC 60 mg/kg，1 次/4 d，同時(shí)給予IL-17 特異性抗體（150μg/鼠）腹腔注射，1 次/周。對(duì)照組和DOC 組腹腔注射鹽水與IL-17 特異性抗體體積相同；各組皮下注射大豆油體積一致。動(dòng)物模型復(fù)制周期為14 d。實(shí)驗(yàn)開始前和實(shí)驗(yàn)第14 天分別采用尾套法測(cè)量各組大鼠收縮壓。動(dòng)物模型復(fù)制周期結(jié)束后，予10%水合氯醛400 mg/kg 腹腔麻醉后處死各組大鼠，摘取心臟，切下心室。將心室分成3 份，1 份放入4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片后做HE 染色、苦味酸-天狼猩紅膠原染色和免疫組織化學(xué)染色。另2 份（心尖部）放入-80℃冰箱凍存，備用于RT-PCR和Westren blotting。

1.4 MF 檢測(cè)

按照苦味酸-天狼猩紅膠原染色法流程對(duì)石蠟切片逐步染色，烤片、封片后使用尼康顯微鏡照相系統(tǒng)拍照，各組隨機(jī)選取圖像。以心肌間質(zhì)膠原面積/視野總面積比值表示心肌間質(zhì)纖維化程度，采用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測(cè)量。

1.5 心肌組織炎癥病理改變

取出部分左心室心肌組織后，直接浸于4%多聚甲醛中固定24 h 充分水洗，脫水，石蠟包埋后將大鼠左室心肌組織切成4μm 厚的薄片，置于防脫載玻片上烤片備用。石蠟切片進(jìn)行HE 染色，觀察心肌組織炎癥反應(yīng)情況。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)M1 型、M2 型巨噬細(xì)胞的表達(dá)

石蠟切片采用檸檬酸鹽修復(fù)液95℃修復(fù)10 min，3%雙氧化氫37℃封閉8 min，10%山羊血清37℃封閉30 min，分別滴加CD11c（1 ∶400）、CD206（1 ∶400）一抗4℃孵育過夜，先后滴加生物素化二抗工作液和辣根標(biāo)記鏈酶卵白素工作液37℃孵育25 min，然后二氨基聯(lián)苯胺顯色。各步驟間用磷酸鹽緩沖液充分洗滌5 次，4 min/次，蘇木精復(fù)染6 min，脫水、透明并封片。磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。使用尼康顯微鏡照相系統(tǒng)隨機(jī)選取陽性表達(dá)區(qū)內(nèi)10 個(gè)視野，在200倍視野下拍攝圖像。利用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件計(jì)算CD11c、CD206 的積分光密度值（integral optical density,IOD），每張切片取平均值。

1.7 RT-PCR 檢測(cè)iNOS 和Arg1 mRNA 的表達(dá)

取適量的左心室心肌組織研磨成勻漿液，按照Qiagen RNA 提取試劑盒說明書步驟提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取總RNA 的純度及濃度。取5μl RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)RT-PCR 試劑盒和RT-PCR 儀推薦的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用RT-PCR儀對(duì)各個(gè)樣品得到的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析并得出Ct 值，采用2-ΔΔCt法對(duì)iNOS 和Arg1 mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量。

1.8 Western blotting 檢測(cè)IL-17、iNOS 和Arg1蛋白的表達(dá)

用RIPA 組織裂解液提取左心室心肌組織總蛋白，BCA 法測(cè)定總蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，加熱變性后電泳，印跡轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜，漂洗、封閉后，將PVDF 膜放入一抗稀釋液中4℃緩慢搖晃孵育過夜。將PVDF 膜放入相應(yīng)的二抗稀釋液中，室溫反應(yīng)2 h，采用辣根過氧化物酶HRP-ECL 底物發(fā)光試劑對(duì)蛋白進(jìn)行顯色，每步驟間充分漂洗，在暗室中曝光后完全定影，通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析定影后的條帶光密度（optical density,OD）。利用Image Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)計(jì)算每個(gè)蛋白條帶OD 值。同樣的方法檢測(cè)內(nèi)參照β-actin 蛋白，樣本目的蛋白相對(duì)含量=目的蛋白條帶OD 值/β-actin 條帶OD 值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠收縮壓比較

SD 大鼠右腎切除術(shù)后，對(duì)照組、DOC 組及DOC+IL-17 組第0 天的收縮壓分別為（134±12）、（139±11）和（130±11）mmHg，第14 天 分 別 為（132±5）、（164±5）和（160±10）mmHg，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的收縮壓比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=59.063，P=0.000）；②各組收縮壓比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.566，P=0.000），DOC 組與DOC+IL-17 組收縮壓比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；③各組收縮壓的變化趨勢(shì)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.323，P=0.000）。

2.2 各組大鼠MF 程度

大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維呈紅色，其余心肌組織呈黃色?？辔端?天狼猩紅膠原染色法結(jié)果顯示：對(duì)照組心肌間質(zhì)膠原面積/視野總面積比值為（3.136±1.389）%、DOC 組 為（32.139±25.300）%、DOC+IL-17 抗體組為（4.540±1.150）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=247.647，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，DOC 組較對(duì)照組增加（P＜0.05）；使用IL-17 抗體中和干預(yù)治療后，DOC+IL-17 抗體組心肌間質(zhì)膠原面積/視野總面積比值較DOC 組減少（P＜0.05）。見圖1、2。

2.3 各組大鼠心肌組織炎癥反應(yīng)

圖1 各組大鼠MF 程度

圖2 各組大鼠MF 程度比較 （n=10，±s）

對(duì)照組大鼠左心室心肌細(xì)胞排列有序，而DOC組心肌細(xì)胞排列紊亂，大量炎癥細(xì)胞浸潤并伴有纖維化瘢痕組織形成；經(jīng)IL-17 抗體中和干預(yù)后，DOC+IL-17 抗體組心肌細(xì)胞排列基本有序，有少量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖3。

2.4 各組大鼠巨噬細(xì)胞浸潤情況

以CD11c 陽性表達(dá)細(xì)胞代表M1 型巨噬細(xì)胞浸潤情況，以CD206 陽性表達(dá)細(xì)胞代表M2 型巨噬細(xì)胞浸潤情況，結(jié)果：①各組CD11c 的IOD 值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，DOC 組CD11c 的IOD 值較對(duì)照組增加（P＜0.05）；使用IL-17 抗體中和干預(yù)治療后，DOC+IL-17 抗體組CD11c 的IOD 值較DOC 組減少（P＜0.05）。②各組CD206 的IOD 值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，DOC 組CD206 的IOD 值較對(duì)照組增加（P＜0.05）；使用IL-17 抗體中和干預(yù)治療后，DOC+IL-17 抗體組CD206 的IOD 值較DOC 組減少（P＜0.05）。見圖4～6 和表2。

圖3 各組大鼠心肌組織病理切片 （HE 染色×200）

圖4 各組大鼠心肌組織CD11c 陽性表達(dá) （免疫組織化學(xué)×200）

圖5 各組大鼠心肌細(xì)胞CD206 陽性表達(dá) （免疫組織化學(xué)×200）

圖6 各組大鼠CD11c、CD206 IOD 值比較 （n=10，±s）

表2 各組大鼠CD11c、CD206 的IOD 值比較 （n=10，±s）

表2 各組大鼠CD11c、CD206 的IOD 值比較 （n=10，±s）

組別 CD11c CD206對(duì)照組 2 812.173±459.245 1 059.458±305.194 DOC 組 13 876.401±2 046.109 6 586.125±647.570 DOC+IL-17 組 5 963.516±847.240 2 754.287±421.503 F 值 194.514 345.888 P 值 0.000 0.000

2.5 各組大鼠iNOS 和Arg1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

M1 型巨噬細(xì)胞分泌iNOS，M2 型巨噬細(xì)胞主要分泌Arg1。各組iNOS 和Arg1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步的兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，DOC 組iNOS 和Arg1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高（P＜0.05）；使用IL-17 抗體中和干預(yù)治療后，DOC+IL-17 抗體組iNOS和Arg1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量較DOC 組降低（P＜0.05）。見圖7和表3。

2.6 各組大鼠IL-17、iNOS 和Arg1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖7 各組大鼠iNOS 和Arg1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

表3 各組大鼠iNOS 和Arg1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

表3 各組大鼠iNOS 和Arg1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

組別 iNOS Arg1對(duì)照組 1.003±0.051 1.002±0.036 DOC 組 2.302±0.118 1.371±0.041 DOC+IL-17 組 1.351±0.092 1.123±0.062 F 值 556.148 157.140 P 值 0.000 0.000

各組IL-17、iNOS 和Arg1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）進(jìn)一步的兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，DOC 組IL-17、iNOS 和Arg1 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組升高（P＜0.05）；使用IL-17 抗體中和干預(yù)治療后，DOC+IL-17 抗體組iNOS和Arg1 蛋白相對(duì)表達(dá)量較DOC 組降低（P＜0.05）。見表4和圖8。

表4 各組大鼠IL-17、iNOS 和Arg1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

表4 各組大鼠IL-17、iNOS 和Arg1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10，±s）

組別 IL-17 iNOS Arg1對(duì)照組 0.924±0.151 3.645±0.456 0.8023±0.346 DOC 組 1.751±0.138 8.785±0.948 2.3472±0.643 DOC+IL-17 組 0.725±0.102 5.864±0.397 0.895±0.507 F 值 163.218 157.515 28.585 P 值 0.000 0.000 0.001

圖8 各組大鼠IL-17、iNOS 和Arg1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n=10）

3 討論

IL-17 是由Th17 細(xì)胞分泌的一種炎癥介質(zhì)，其通過調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子、趨化因子等表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，從而誘導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生、放大[9]。MF 過程中存在低度炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)通過炎癥細(xì)胞的聚集、激活，導(dǎo)致心臟成纖維細(xì)胞異常增殖，被認(rèn)為是心室重構(gòu)的起始因子[10-11]。巨噬細(xì)胞是心臟主要炎癥細(xì)胞，在啟動(dòng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。健康心臟組織中，巨噬細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的1%～5%，但心肌損傷后，其數(shù)量顯著增加[12-13]。巨噬細(xì)胞具有高度可塑性和分化潛能，在不同組織微環(huán)境中，可以發(fā)生表型、功能的極化，呈現(xiàn)出不同功能，這是巨噬細(xì)胞在MF 中發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素[14]。本研究通過復(fù)制DOC/鹽誘導(dǎo)的高血壓性大鼠模型，應(yīng)用IL-17 抗體干預(yù)，發(fā)現(xiàn)IL-17 可能通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化，發(fā)揮促炎和促纖維化作用。

巨噬細(xì)胞的亞型受其極化狀態(tài)的調(diào)控，而巨噬細(xì)胞不同的亞型在組織中的聚集和激活方式不同[15]。巨噬細(xì)胞大致分為2 類：M1 型和M2 型，分別發(fā)揮不同的作用，且其極化狀態(tài)受多種因素調(diào)節(jié)，這對(duì)于疾病的治療具有重要意義[16-17]。M1 型特征性表達(dá)CD11c，可分泌iNOS、IL-1 等促炎細(xì)胞因子，具有細(xì)胞毒性，也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的炎癥損傷，發(fā)揮促炎作用。M2 型高表達(dá)CD206，主要分泌Arg1、IL-4 等，起到組織修復(fù)等作用[18]。在不同微環(huán)境下，巨噬細(xì)胞可激活極化為M1 型或M2 型，不同的表型之間可相互轉(zhuǎn)換[19]。有研究顯示，在心肌缺血早期，以M1 型巨噬細(xì)胞募集為主，加速心肌的凋亡，而在心肌缺血中晚期，以M2 型巨噬細(xì)胞募集為主，參與MF 的發(fā)生，這表明巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)改變是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞聚集和激活的重要機(jī)制[20]。而前期研究均籠統(tǒng)地將各型巨噬細(xì)胞混在一起，未充分重視巨噬細(xì)胞極化對(duì)MF 的重要作用，本研究以CD11c 和CD206 分別標(biāo)記2 種巨噬細(xì)胞，顯示在DOC/鹽誘導(dǎo)的MF 大鼠中，M1 型巨噬細(xì)胞和M2 型巨噬細(xì)胞均增加，M1 型巨噬細(xì)胞增加更加明顯，提示M1 型巨噬細(xì)胞在MF 炎癥反應(yīng)階段發(fā)揮重要作用。

近年來新發(fā)現(xiàn)一類CD4+T 細(xì)胞亞群，其功能特征與之前發(fā)現(xiàn)的Th 細(xì)胞亞群Th1、Th2 不同，主要分泌IL-17，誘導(dǎo)機(jī)體局部組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生、放大和級(jí)聯(lián)反應(yīng)[5，21]。當(dāng)前探討IL-17 陽性的細(xì)胞對(duì)免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用已成為研究熱點(diǎn)之一[22-23]。有研究表明，IL-17 參與病毒性心肌炎、肝臟纖維化等多種疾病的病理過程[24]。有報(bào)道表明，IL-17 在MF 中發(fā)揮重要作用[25]。其作用機(jī)制不明確，是否對(duì)影響巨噬細(xì)胞的極化尚無報(bào)道。有研究提示IL-17 在DOC/鹽誘導(dǎo)的MF 進(jìn)程中表達(dá)水平升高，抑制IL-17 表達(dá)能減輕纖維化進(jìn)程[26]。本研究亦顯示MF 大鼠在IL-17表達(dá)增加的同時(shí)M1 型巨噬細(xì)胞表達(dá)同時(shí)增加，應(yīng)用IL-17 抗體干預(yù)后，隨著IL-17 減少，M1 型巨噬細(xì)胞表達(dá)亦減少，心肌間質(zhì)膠原蛋白量同時(shí)減少，很可能說明IL-17 通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的極化在MF 中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，在DOC/鹽誘導(dǎo)的MF 大鼠中，IL-17和巨噬細(xì)胞表達(dá)均增加，發(fā)揮重要作用，伴隨IL-17的中和，M1 型巨噬細(xì)胞數(shù)量隨之減少，表明巨噬細(xì)胞極化很可能與IL-17 有關(guān)，而IL-17 具體調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。