趙遠(yuǎn) 朱勇康 陸燕飛 尚林偉 符娟娟 馬丹英 王瀟 尹建華

摘?要?衰減全反射傅里葉變換紅外光譜技術(shù)（ATR-FTIR）可實(shí)現(xiàn)微量樣本的快速可靠的在體紅外光譜檢測(cè)。本研究采用自行搭建的空芯光纖（HOF）ATR-FTIR探針技術(shù)，結(jié)合主成分分析（PCA）及Fisher判別（FDA）算法，對(duì)不同病變階段（健康，病變8周、3個(gè)月、7個(gè)月）比格犬的骨關(guān)節(jié)炎（OA）離體樣本進(jìn)行原位鑒別分析。對(duì)初始樣本識(shí)別正確率為100%;各組分別選取一獨(dú)立樣本作為預(yù)測(cè)組，預(yù)測(cè)組樣本識(shí)別正確率為100%;所有交叉驗(yàn)證的識(shí)別率均超過95%。本方法能客觀地準(zhǔn)確鑒別不同病變階段的OA樣本，可作為不同OA病變階段的診斷參考。結(jié)合主觀的OA評(píng)分結(jié)果，HOF-ATR-FTIR技術(shù)在OA的在體原位臨床診斷中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，有望為OA提供更加客觀精確的光譜分級(jí)和分期結(jié)果。

關(guān)鍵詞?骨關(guān)節(jié)炎; 空芯光纖-衰減全反射傅里葉變換紅外光譜; 主成分分析; Fisher判別

1?引 言

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是由生物因素和機(jī)械性損傷相互作用引起的一系列病理生理變化進(jìn)而產(chǎn)生的生物力學(xué)紊亂所致[1]，在OA的治療中，最為關(guān)鍵的是對(duì)OA實(shí)現(xiàn)早期診斷、早期預(yù)防、早期治療。臨床上OA診斷分級(jí)的經(jīng)典手段包括Kellgren和Lawrecne的放射學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)[1，2]、美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)院提出的X線/臨床加X線診斷[1]等; 實(shí)驗(yàn)室中常根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨的病理?yè)p傷作為OA病變?cè)u(píng)分/分級(jí)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，常用的有Mankin評(píng)分（HHGS評(píng)分）[1，3～5]、OARSI osteoarthritis cartilage histopathology assessment system（OOCHAS評(píng)分）[1～3，6]等。然而這些方法或不能在發(fā)病初期診斷出不易被察覺的軟骨基質(zhì)的毀壞和不明顯的機(jī)械傷害，或難于對(duì)軟骨基質(zhì)實(shí)現(xiàn)原位探測(cè)，且受主觀因素影響較大，因此發(fā)展有效的OA監(jiān)測(cè)和診斷技術(shù)方法對(duì)OA的研究及臨床診療有著重要意義。

針對(duì)OA的診斷除了影像學(xué)檢查（X線檢查、CT檢查、磁共振檢查、超聲學(xué)檢查、核素掃描等[1]）、生化手段檢查（血液檢查、尿液檢查、關(guān)節(jié)滑液檢查等[1]）外，越來(lái)越多的研究采用傅里葉變換紅外（FTIR）光譜技術(shù)[7～11]。通過FTIR光譜技術(shù)，可從分子水平對(duì)樣本的變化進(jìn)行研究。衰減全反射（ATR）技術(shù)則是適用于小面積、小體積測(cè)量的光學(xué)技術(shù)，且對(duì)樣品預(yù)處理沒有特殊要求[12～17]。自20世紀(jì)90年代初開始，其被引入到FTIR光譜學(xué)，特別是進(jìn)一步與光纖聯(lián)用[14]，可準(zhǔn)確、快速、靈活地應(yīng)用于組織的原位紅外光譜檢測(cè)中，實(shí)現(xiàn)對(duì)微量樣本的在體紅外光譜檢測(cè)，具有良好的臨床診斷應(yīng)用前景。

在本課題組的同期研究中，將主成分分析（PCA）、Fisher判別（FDA）引入到FTIR成像對(duì)正常和病變關(guān)節(jié)軟骨樣本的識(shí)別研究[18，19]。FDA方法是一種可借助方差分析建立判別函數(shù)并對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行快速分類識(shí)別的有監(jiān)督算法，本課題組高準(zhǔn)確率地實(shí)現(xiàn)了對(duì)正常和病變的關(guān)節(jié)軟骨樣本的識(shí)別，證明了PCA-FDA方法應(yīng)用于OA離體切片診斷的可靠性及穩(wěn)定性。但FTIR成像需要對(duì)樣本進(jìn)行切片后再進(jìn)行光譜采集和成像，是非原位光譜測(cè)量。在近期研究中，本課題組開發(fā)出空芯光纖（HOF）ATR-FTIR聯(lián)用技術(shù)，可用于軟骨及OA的原位探測(cè)[14]。本研究將空芯光纖-衰減全反射傅里葉變換紅外光譜（HOF-ATR-FTIR）技術(shù)與PCA-FDA方法結(jié)合，在獲得不同病變階段的離體原位OA樣本的ATR紅外光譜信息后，進(jìn)行快速有監(jiān)督分類識(shí)別，為OA臨床前的原位定量分類和分期提供了參考。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?樣本處理及關(guān)節(jié)炎評(píng)分

實(shí)驗(yàn)所用樣本均由江蘇亞東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究院提供。選擇8只健康比格犬，對(duì)其中2只的左后腿膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)進(jìn)行原位提取，從而獲取健康樣本;其余6只進(jìn)行單后腿（左后腿/右后腿）的膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶橫斷手術(shù)[3]，以誘導(dǎo)OA病變發(fā)生。OA造模術(shù)后，6只模型犬分為3組，分別培養(yǎng)8周（8w-1 & 8w-2）、3個(gè)月（3m-1 & 3m-2）以及7個(gè)月（7m-1 & 7m-2）后，對(duì)其手術(shù)側(cè)的后腿膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)進(jìn)行原位樣本提取，使用生理鹽水進(jìn)行清洗以備用。樣本的培育和取樣遵循本單位和協(xié)作單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)要求。

前文提及的OOCHAS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)損傷深度及相應(yīng)組織反應(yīng)將OA分為0～6級(jí)，根據(jù)損傷范圍的大小將OA分為0～4期，其分級(jí)與分期的乘積即為最終得分[3]。OOCHAS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)OA早期的分期較為精細(xì)[3]，因此本研究按照此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)，得到評(píng)分結(jié)果如表1所示。

2.2?光譜采集及數(shù)據(jù)分析

樣本清洗后，將目標(biāo)樣本置于三維樣本臺(tái)上，采用自制的HOF-ATR探頭[16]并耦合傅里葉變換紅外光譜儀（Vertex 70，Bruker公司）對(duì)樣本進(jìn)行多點(diǎn)原位光譜采集（點(diǎn)位數(shù)如表1所示），其中光譜采集和光譜處理使用光譜儀配套的OPUS 7.0軟件進(jìn)行。表1中，樣本8w-1、8w-2所檢測(cè)點(diǎn)位中均包含半月板未覆蓋區(qū)域的1個(gè)點(diǎn)以及半月板覆蓋區(qū)域的4個(gè)點(diǎn)（其中均有1個(gè)明顯損傷點(diǎn)）。樣本3m-1、3m-2所檢測(cè)點(diǎn)位中均包含半月板未覆蓋區(qū)域的2個(gè)點(diǎn)以及半月板覆蓋區(qū)域的4個(gè)點(diǎn)。樣本7m-1（7m-2）所檢測(cè)點(diǎn)位中包含半月板未覆蓋區(qū)域的3（2）個(gè)點(diǎn)以及包含半月板覆蓋區(qū)域的3（3）個(gè)點(diǎn)，其中樣本7m-1對(duì)半月板未覆蓋區(qū)域磨損嚴(yán)重位置補(bǔ)充檢測(cè)1個(gè)點(diǎn)。樣本Healthy-1、Healthy-2所檢測(cè)點(diǎn)位中均包含半月板未覆蓋區(qū)域的4個(gè)點(diǎn)以及半月板覆蓋區(qū)域的5個(gè)點(diǎn)。光譜采集范圍為4000～ 900 cm1，間隔4 cm1。

對(duì)所檢測(cè)的光譜數(shù)據(jù)使用OPUS 7.0軟件進(jìn)行基線校正后，先采用IBM SPSS Statistics 22軟件對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，再選擇適當(dāng)?shù)闹鞒煞忠蜃舆M(jìn)行有監(jiān)督FDA。FDA處理過程中，分別將樣本8w-1、3m-2、7m-1、Healthy-1的光譜數(shù)據(jù)作為預(yù)測(cè)組，各自與本組剩余犬（數(shù)據(jù)）及其它組一起構(gòu)成對(duì)應(yīng)訓(xùn)練組。

3?結(jié)果與討論

3.1?光譜分析

圖1為對(duì)健康（Healthy）和OA 犬關(guān)節(jié)軟骨原位檢測(cè)的HOF-ATR-FTIR光譜。3276 cm1譜帶是Amide A帶（NH鍵的伸縮）[20]，1749 cm1表示CO的伸縮振動(dòng)（來(lái)自于軟骨細(xì)胞中以及軟骨細(xì)胞周圍基質(zhì)中的脂質(zhì)）[21～24]，1338 cm1源自膠原的CH2振動(dòng)[8，25]。Amide Ⅰ、Amide Ⅱ更多來(lái)自于膠原蛋白，而1079 cm1來(lái)自蛋白多糖（PG）[26]。軟骨中Amide III帶既不適用于軟骨膠原蛋白的含量表征，也不適用于PG的含量表征[26，27]。

健康和患關(guān)節(jié)炎7個(gè)月的犬關(guān)節(jié)軟骨的特征譜帶吸光度（積分面積）見表2。根據(jù)文獻(xiàn)[8]，OA病變6個(gè)月（與本研究中病變7個(gè)月時(shí)的病理狀況接近）時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨中以Amide I表征的膠原的含量變化不明顯，因此，對(duì)比于健康關(guān)節(jié)軟骨，OA關(guān)節(jié)軟骨1/Amide I明顯降低，表明受OA影響，軟骨表層軟骨細(xì)胞內(nèi)及周圍基質(zhì)中的脂質(zhì)含量減少，可能暗示著軟骨細(xì)胞在逐漸的退變或凋亡。Amide I/Amide II相對(duì)強(qiáng)度降低（2.78Healthy→2.12OA），表明OA關(guān)節(jié)軟骨表面膠原纖維的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[8]。1338 cm1/Amide II相對(duì)強(qiáng)度也降低（0.10 Healthy→0.05 OA），表明OA關(guān)節(jié)軟骨表面膠原蛋白的完整性發(fā)生了改變[8]。1079 cm1/Amide I的吸光度增加表明，隨著OA的發(fā)生，軟骨表面PG的含量增加。文獻(xiàn)[8]研究結(jié)果表明，病變6個(gè)月時(shí)，在軟骨細(xì)胞附近基質(zhì)內(nèi)，PG的含量隨著軟骨的退變而增加，膠原的含量變化不明顯，但膠原完整性下降; 同時(shí)受膠原結(jié)構(gòu)變化影響，1338 cm1譜峰強(qiáng)度降低，本研究結(jié)果與之一致。此外，3276 cm1的含量發(fā)生變化的同時(shí)，肩峰的相對(duì)強(qiáng)度也明顯改變，表明Amide A也可能受OA的影響發(fā)生了含量的變化。

3.2?PCA-FDA

表3所示為PCA主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率，可見經(jīng)PCA降維，前4個(gè)主成分（包括膠原蛋白、蛋白多糖、水等成分[26]）的累計(jì)貢獻(xiàn)率即超過90%（達(dá)到92.11%），因此選擇前4個(gè)主成分因子進(jìn)行FDA處理。

以8w-1犬的原位光譜數(shù)據(jù)為預(yù)測(cè)組，F(xiàn)DA分類結(jié)果及訓(xùn)練組的交互驗(yàn)證結(jié)果如表4所示，訓(xùn)練組初始樣本均全部正確識(shí)別; 預(yù)測(cè)組樣本識(shí)別正確率為100%; 交互驗(yàn)證案例的總識(shí)別正確率為97.8%。對(duì)誤判點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，僅有的1個(gè)誤判點(diǎn)來(lái)自樣本8w-2軟骨端面明顯損傷點(diǎn)（圖2B），表明此位置膠原結(jié)構(gòu)可能受到破壞，軟骨基質(zhì)的成分和含量受到影響，導(dǎo)致被誤判為OA 7個(gè)月樣本。

以樣本3m-2犬的光譜數(shù)據(jù)為預(yù)測(cè)組時(shí)，訓(xùn)練組初始樣本均全部正確識(shí)別; 預(yù)測(cè)組樣本全部正確識(shí)別; 交互驗(yàn)證案例的總識(shí)別正確率為95.6%。對(duì)誤判點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，一個(gè)誤判點(diǎn)來(lái)自樣本8w-1軟骨端面明顯損傷點(diǎn)（圖2A），類似上述樣本8w-2，此位置膠原結(jié)構(gòu)也可能受到破壞，故導(dǎo)致此位置被判斷為來(lái)自病變7個(gè)月樣本; 另一個(gè)誤判點(diǎn)來(lái)自樣本7m-2軟骨端面相對(duì)正常位置（圖2C），軟骨的破壞程度相對(duì)整體而言較輕，導(dǎo)致將此位置被判斷為來(lái)自病變8周樣本。

以樣本7m-1犬的原位光譜數(shù)據(jù)為預(yù)測(cè)組時(shí)，訓(xùn)練組初始樣本均識(shí)別正確率100%; 預(yù)測(cè)組樣本正確率100%; 交互驗(yàn)證案例的總識(shí)別正確率為97.8%。對(duì)誤判點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，僅有的一個(gè)誤判點(diǎn)來(lái)自樣本8w-2軟骨端面明顯損傷點(diǎn)（圖2B），與表4的FDA結(jié)果誤判原因一致。

以樣本Healthy-1犬的光譜數(shù)據(jù)為預(yù)測(cè)組時(shí)，訓(xùn)練組初始樣本的識(shí)別正確率100%; 預(yù)測(cè)組樣本正確率100%; 交互驗(yàn)證案例的總識(shí)別正確率為95.2%。對(duì)誤判點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，一個(gè)誤判點(diǎn)來(lái)自8w-1樣本軟骨端面明顯損傷點(diǎn)（圖2A），另一個(gè)誤判點(diǎn)來(lái)自樣本7m-2軟骨端面相對(duì)正常位置（圖2C），發(fā)生誤判原因與以樣本3m-2犬的光譜數(shù)據(jù)為預(yù)測(cè)組時(shí)的FDA結(jié)果誤判原因一致。

根據(jù)上述PCA-FDA分析結(jié)果，各訓(xùn)練組初始樣本均可100%正確識(shí)別，且對(duì)各預(yù)測(cè)組也均可準(zhǔn)確識(shí)別，考慮到本研究所用樣本較少（每組2只犬），因此采用分組預(yù)測(cè)驗(yàn)證。分別以不同時(shí)期樣本作為預(yù)測(cè)組時(shí)，交叉驗(yàn)證的總識(shí)別正確率均超過95%，對(duì)出現(xiàn)誤差檢測(cè)點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)：（1）病變8周樣本誤判為來(lái)自病變7個(gè)月樣本（8w-1、8w-2）的檢測(cè)點(diǎn)均為所在軟骨端面明顯損傷點(diǎn)，因?yàn)榇宋恢媚z原纖維結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致使所在點(diǎn)的光譜特征更接近病變7個(gè)月組而發(fā)生誤判; （2）病變7個(gè)月樣本誤判為來(lái)自病變8周樣本（7m-2）的檢測(cè)點(diǎn)為所在軟骨端面相對(duì)正常位置，此位置膠原纖維結(jié)果相對(duì)完整，導(dǎo)致所在點(diǎn)的光譜特征更接近病變8周組，進(jìn)而發(fā)生誤判; （3）樣本差異及過擬合也可能是導(dǎo)致誤判發(fā)生的因素。綜上可見，HOF-ATR-FTIR光譜技術(shù)結(jié)合PCA-FDA方法有能力對(duì)不同病變階段的OA實(shí)現(xiàn)高精度分類鑒別。

OOCHAS評(píng)分是基于對(duì)軟骨損傷的深度和長(zhǎng)度而進(jìn)行綜合評(píng)估（分級(jí)×分期）的一種半定量評(píng)價(jià)方法，總分24分。將評(píng)分 ≤ 12分（共10個(gè)檔次）的樣本歸類為OA早期階段，而將評(píng)分>12分（5個(gè)檔次）的結(jié)果歸類為OA中晚期階段[3]。依此而言，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶橫斷手術(shù)后培養(yǎng)的OA樣本中，病變8周（OOCHAS評(píng)分2分）、3個(gè)月（OOCHAS評(píng)分4分）樣本均處于OA早期[3]。客觀而言，OOCHAS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)更適合對(duì)OA早期進(jìn)行較精細(xì)的評(píng)級(jí)，而僅將中晚期劃分為5個(gè)檔次，無(wú)形中模糊了對(duì)OA中期的精確劃分，將中期、晚期病變統(tǒng)一劃入了中晚期的范疇，這也是表1中病變7個(gè)月樣本（OOCHAS評(píng)分18分）被誤判為OA中晚期的原因。

相對(duì)于半定量的OOCHAS評(píng)分方法，基于組織切片病理染色的Mankins 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)更適用于對(duì)OA中晚期的評(píng)價(jià) [3]，兩種主觀評(píng)分方法互補(bǔ)，可對(duì)OA的早中晚分期進(jìn)行較均勻、全面的主觀評(píng)價(jià)。采用本研究建立的HOF-ATR-FTIR & PCA-FDA定量判別技術(shù)，必要時(shí)聯(lián)合內(nèi)窺鏡技術(shù)進(jìn)行在體原位探測(cè)，通過采集和豐富不同病變（分期）階段的OA光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，或聯(lián)用其它診斷工具，在主客觀評(píng)判方法之間建立相關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)，將有望對(duì)疑似OA患者進(jìn)行更客觀快速的分級(jí)/分期在體原位診斷。

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