王肖莉 姚猛 李引 魏超 王美

摘?要?以7-硝基苯并呋咱（NBD）為熒光團，經(jīng)一步有機合成，高產(chǎn)率制備比色熒光雙通道探針，用于檢測環(huán)境和體內(nèi)硫化氫（H2S）的含量。以無水Na2S為H2S供體，考察了探針的選擇性、靈敏性等性能。結(jié)果表明，探針熒光強度與H2S濃度在5～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.125 μmol/L，同時反應(yīng)溶液由無色變?yōu)樽仙?。采用MTT法測試探針的細胞毒性，結(jié)果表明，在探針濃度低于50 μmol/L條件下，細胞存活率高于90%。激光掃描共聚焦顯微成像結(jié)果表明，探針可靶向細胞溶酶體，可對溶酶體內(nèi)H2S進行成像研究。

關(guān)鍵詞?硫化氫; 比色檢測; 熒光探針; 細胞成像

1?引 言

硫化氫（H2S）是一種無色且具有臭雞蛋氣味的氣體，一般由工業(yè)中含硫物質(zhì)非完全燃燒產(chǎn)生，被認為是一種有毒環(huán)境污染物。近年的研究發(fā)現(xiàn)，H2S是生命體內(nèi)一種重要的內(nèi)源性氣體信號分子，參與多種重要的生理過程[1～4]，H2S濃度異常與許多疾病有關(guān)，如阿爾茨海默氏癥、唐氏綜合癥、糖尿病和肝硬化等[5，6]。但是，其在體內(nèi)的潛在分子機制尚不明確[7，8]。因此，基于H2S在環(huán)境和生命體內(nèi)的重要作用，開發(fā)靈敏有效的分析方法具有重要的意義[9]。

傳統(tǒng)的H2S檢測方法包括吸收光譜法、電化學(xué)法、氣相色譜法和硫沉淀法等[10～13]，而光學(xué)探針法發(fā)展迅速。其中，比色法可不借助昂貴的儀器設(shè)備，直接對目標物裸眼分析; 熒光探針法選擇性好、靈敏度高，可對生物樣本（細胞、組織和活體等）內(nèi)目標物進行實時熒光成像研究。基于H2S的化學(xué)性質(zhì)（還原性、親核性等），研究者發(fā)展了多種反應(yīng)型H2S熒光探針[14～16]，包括還原型（芳香疊氮/硝基/羥胺還原為胺基）[17～20]、親核型（親核取代[21，22]、親核加成/雙親核加成[23，24]）、形成CuS沉淀型[25]等。近年來，雖然已報道了大量H2S熒光探針，但是開發(fā)兼具制備簡便、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點，并能夠?qū)崿F(xiàn)比色和熒光雙通道檢測H2S的優(yōu)良的探針分子，用于檢測環(huán)境和生物樣品中的H2S，仍然是當(dāng)前的研究熱點。

2013年，本研究組[26]和Pluth研究組[27]分別發(fā)現(xiàn)7-硝基苯并呋咱（NBD）胺可與H2S發(fā)生親核取代反應(yīng)，其產(chǎn)物NBD-SH可用于比色檢測H2S?；诖耍枚喾N光物理擾動原理，構(gòu)建了系列選擇性檢測H2S的比色熒光雙通道探針[28～30]。進一步利用NBD優(yōu)秀的熒光性質(zhì)，本研究組[31]和易龍研究組[32]分別構(gòu)建了以7-羥基香豆素連NBD為骨架結(jié)構(gòu)的比例計量型H2S熒光探針，實現(xiàn)了細胞線粒體和溶酶體內(nèi)H2S的比例成像研究。

考慮到上述探針分子需要多步有機合成進行制備，本研究以NBD為熒光團，嗎啉為溶酶體靶向基團，經(jīng)一步有機反應(yīng)，設(shè)計合成了新型比色熒光雙通道H2S探針NBD-M。此探針本身具有熒光，與H2S反應(yīng)后的產(chǎn)物NBD-SH在水溶液中熒光較弱，因此，可產(chǎn)生由開到關(guān)的熒光變化; 同時，利用產(chǎn)物NBD-SH的顏色變化可比色檢測溶液中H2S。考察了探針的溶酶體靶向的功能，并測試了探針檢測細胞溶酶體內(nèi)H2S的能力。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Brucker 600核磁共振儀（美國Brucker公司，TMS為內(nèi)標）; Varian 7.0 T FTICR-MS質(zhì)譜儀、UV-3600型分光光度計（美國Agilent公司）; F-7000型熒光光譜儀（日本日立公司）; PHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）; ZF-7型三用紫外分析儀、X-4顯微熔點儀（上海精密儀器儀表有限公司）。4-氯-7-硝基苯并呋咱和嗎啉（阿拉丁試劑有限公司）; 其它試劑均購于天津光復(fù)試劑公司。所用試劑均為市售分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

2.2?探針NBD-M的合成

將200 mg （1.00 mmol） NBD-Cl和91 mg （1.05 mmol）嗎啉溶解于10 mL二氯甲烷，向其中加入209 μL （1.50 mmol）三乙胺，室溫反應(yīng)1 h后，加入10 mL水，萃取，有機相加入無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，所得粗品用硅膠柱分離（二氯甲烷-甲醇，100∶1，V/V）得淡紅色固體，產(chǎn)率90%。熔點：147.2～148.5℃。1H NMR （DMSO-d6，600 MHz），δ （ppm）： 8.51 （d，J=9.0 Hz，1H），6.68 （d，J=9.0 Hz，1H），4.13～4.12 （m，4H），3.85～3.83 （m，4H）。 13C NMR （DMSO-d6，151 MHz），δ （ppm）： 14539，14475，14473，13621，12136，10342，6567，4947。 MS （ESI+） calcd for [M+H+]?341.1，found 341.2。探針NBD-M的合成路線見下式。

2.3?光譜測試

配制2 mmol/L探針的DMSO溶液，在室溫下、磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4，0.02 mol/L）中進行光譜測試，探針濃度為 10 μmol/L，激發(fā)波長為490 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。選擇性測試所需各種潛在干擾物質(zhì)均溶于純PBS，測試濃度為200 μmol/L。

2.4?細胞成像

細胞培養(yǎng)實驗方法和條件參見電子版文后支持信息。HeLa細胞接種于35 mm細胞成像專用玻底培養(yǎng)皿，成像細胞密度為2×104。加入NBD-M （10 μmol/L）和商品化溶酶體定位探針Lyso-Tracker Red （20 nmol/L）共孵育30 min，用PBS洗滌3次后，進行共定位成像研究。探針NBD-M熒光通道激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長范圍500～550 nm; Lyso-Tracker Red熒光通道激發(fā)波長為546 nm，波長采集范圍590～640 nm。

3?結(jié)果與討論

3.1?探針的光譜性質(zhì)

探針的熒光性質(zhì)是探針熒光檢測和成像的基礎(chǔ)?？疾炝瞬煌軇μ结樧贤馕蘸蜔晒獍l(fā)射光譜的影響。隨著溶劑極性增加，探針的最大紫外和熒光發(fā)射均發(fā)生紅移（電子版文后支持信息表S1）。如圖1所示，在PBS中，探針的最大紫外吸收和熒光發(fā)射分別為496和576 nm，斯托克斯位移高達80 nm，在實際應(yīng)用中可有效避免激發(fā)光對檢測光譜信號的干擾。

3.2?探針對H2S的識別性能研究

在PBS （ 0.02 mol/L，pH 7.4）溶液中，探針的最大紫外吸收峰強度在探針濃度0～4.0 × 104 mol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9993），表明探針具有良好的水溶性（電子版文后支持信息圖S2）。如圖2所示，將探針溶液（ 10 μmol/L）和新配H2S 溶液（200 μmol/L）混合，30 min后反應(yīng)體系的熒光信號基本穩(wěn)定。計算所得探針與H2S反應(yīng)的假一級反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)（kobs）約為2.1 × 103 s1，二級反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)（k2）為10.5 L/（moL·s），與其它NBD基親核取代型H2S熒光探針的常數(shù)的數(shù)量級相當(dāng)[18，26]，表明探針可作為一種快速檢測H2S的熒光關(guān)閉型探針。

Na+、Ca2+、Fe2+、Ba2+、Mg2+、Cu2+、F、Cl、Br、I、NO3、SO24、NO2、HClO、Vc、KO2、SO23、H2O2、Hcy、Cys、GSH、H2S），測試其熒光發(fā)射光譜（λex=490 nm）。如圖3所示，H2S可使探針的熒光顯著降低，而其它物質(zhì)不會明顯改變探針的熒光強度，表明探針NBD-M對H2S的熒光響應(yīng)具有較高的選擇性。

為了評估探針對H2S的檢測靈敏性，進行了熒光滴定實驗。向探針溶液（10 μmol/L）中依次加入不同濃度（0～100 μmol/L）的新配H2S溶液，孵育15 min，探針與576 nm處的最大發(fā)射峰熒光強度逐漸增強（圖4?。?。如圖4B所示，在5～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)，H2S的濃度與探針的熒光強度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=266.13-3.43x （r=0.9942），檢出限為0.125 μmol/L （S/N=3），與已報道文獻相當(dāng)[26]。上述結(jié)果表明，探針NBD-M可定量檢測H2S的濃度，具有較高的靈敏度。

探針與H2S反應(yīng)后，探針最大紫外吸收峰發(fā)生明顯紅移（電子版文后支持信息圖S3）。文獻報道，探針與H2S反應(yīng)后，產(chǎn)物NBD-SH具有明顯的顏色[26，27]。向探針溶液（10 μmol/L）中加入0、10、20、30、40、50、75 和100 μmol/L的新配H2S溶液，室溫孵育5 min后，可明顯觀察到溶液由淡黃色變?yōu)樽仙⑶译S著H2S加入量的增加，溶液紫色逐漸加深（圖5）?；谔结樔芤旱念伾兓c不同H2S濃度之間的相關(guān)性，可簡便地半定量檢測水樣中20 μmol/L H2S。因此，探針NBD-M可實現(xiàn)對H2S的比色和熒光雙通道檢測。

3.3?探針對H2S的識別機制研究

為了研究探針與H2S的識別機制，向探針溶液中加入等摩爾數(shù)的H2S，測試了探針與H2S反應(yīng)前后的核磁共振氫譜。探針1位和2位芳香氫的化學(xué)位移分別為6.67和8.51 ppm，與H2S反應(yīng)后，此位置芳香氫的化學(xué)位移分別7.00 ppm和8.07 ppm移動到7.42 ppm。結(jié)合探針與H2S反應(yīng)的紫外吸收光譜和溶液顏色變化，推測探針與H2S發(fā)生如圖6所示的親核取代反應(yīng)。

3.4?探針對細胞內(nèi)H2S熒光成像研究

熒光關(guān)閉型熒光探針已被報道用于內(nèi)源性H2S的成像研究[33～35]。利用四唑鹽（MTT）比色法，對探針的細胞毒性進行評價，發(fā)現(xiàn)探針在濃度低于50 μmol/L時，細胞存活率高于90%，可用于細胞實驗研究（電子版文后支持信息圖S4）。

一些小分子胺類基團（如嗎啉、N，N-二甲基胺等）本身具有堿性，含有此類結(jié)構(gòu)的熒光探針能夠選擇性地積累在弱酸性細胞器，實現(xiàn)溶酶體定位功能。利用商品化溶酶體定位探針（Lyso-Tracker Red）進行細胞器共定位成像研究。如圖7所示，向HeLa細胞加入含有20 nmol/L共定位探針Lyso-Tracker Red和10 μmol/L探針NBD-M的培養(yǎng)基，共孵育15 min，可觀察到兩個探針光譜重疊良好，共定位皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.93[36]，表明探針具有良好的溶酶體定位能力。

利用探針對細胞內(nèi)H2S進行熒光成像研究。如圖8所示，HeLa細胞在含有10 μmol/L探針的培養(yǎng)基中孵育15 min，可觀察到明顯的黃色熒光（圖8A）; 先孵育100 μmol/L H2S 30 min，再孵育探針15 min，黃色熒光明顯降低（圖8B）; 先孵育200 mol/L H2S 30 min，再孵育探針15 min，黃色熒光基本完全消失（圖8C）。熒光成像實驗表明，探針NBD-M能夠用于HeLa細胞溶酶體內(nèi)H2S的成像研究。

4?結(jié) 論

合成了一種新型比色-熒光雙通道探針NBD-M，能夠高選擇性和高靈敏識別H2S。探針與H2S反應(yīng)后，溶液顏色由無色逐漸變?yōu)樽仙軌蚵阊蹤z測含20 μmol/L H2S的水樣，具有一定的應(yīng)用前景。此探針能夠靶向HeLa細胞溶酶體，可用于細胞內(nèi)H2S的成像研究。

References

1?Szabo C. Nat. Rev. Drug Discov.，2007，6（11）： 917-935

2?Li L，Rose P，Moore P K. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.，2011，51： 169-187

3?Wallace J L，Wang R. Nat. Rev. Drug Discov.，2015，14（5）： 329-345

4?Kimura H，Shibuya N，Kimura Y. Antioxid. Redox Sign.，2012，17（1）： 45-47

5?Kamoun P，Belardinelli M C，Chabli A，Lallouchi K，Chadefaux-Vekemans B. Am. J. Med. Genet. A，2003，116A（3）： 310-311

6?Fiorucci S，Antonelli E，Mencarelli A，Orlandi S，Renga B，Rizzo G，Distrutti E，Shah V，Morelli A. Hepatology，2005，42（3）： 539-548

7?Paul B D，Snyder S H. Antioxid. Redox Sign.，2015，22（5）： 411-423

8?Furne J，Saeed A，Levitt M D. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol.，2008，295（5）： R1479-R1485

9?Kolluru G K，Shen X，Bir S C，Kevil C G. Nitric Oxide，2013，35： 5-20

10?Radford-Knaery J，Wang J. Anal. Chem.，1993，65（8）： 976-982

11?Lawrence N S，Deo R P，Wang J. Anal. Chim. Acta，2004，517（1-2）： 131-137

12?Gu X，Liu C，Zhu Y C，Zhu Y Z. Tetrahedron Lett.，2011，52（39）： 5000-5003

13?Ishigami M，Hiraki K，Umemura K，Ogasawara Y，Ishii K，Kimura H. Antioxid. Redox Sign.，2009，11（2）： 205-214

14?GAO Min，YU Fa-Biao，CHEN Ling-Xin. Prog. Chem.，2014，26（6）： 1065-1078

高 敏，于法標，陳令新. 化學(xué)進展，2014，26（6）： 1065-1078

15?Lin V S，Chen W，Xian M，Chang C J. Chem. Soc. Rev.，2015，44（14）： 4596-4618

16?Bruemmer K J，Brewer T F，Chang C J. Curr. Opin. Chem. Biol.，2017，39： 17-23

17?Lippert A R，New E J，Chang C J. J. Am. Chem. Soc.，2011，133（26）： 10078-10080

18?Zhou G D，Wang H L，Ma Y，Chen X Q. Tetrahedron，2013，69（2）： 867-870

19?Montoya L A，Pluth M D. Chem. Commun.，2012，48（39）： 4767-4769

20?Xuan W，Pan R，Cao Y，Liu K，Wang W. Chem. Commun.，2012，48（86）： 10669-10671

21?Zhao C C，Zhang X L，Li K B，Zhu S J，Guo Z Q，Zhang L L，Wang F Y，F(xiàn)ei Q，Luo S H，Shi P，Tian H，Zhu W H. J. Am. Chem. Soc.，2015，137（26）： 8490-8498

22?Lv J，Wang F，Qiang J，Ren X T，Chen Y H，Zhang Z J，Wang Y，Zhang W，Chen X Q. Biosens.Bioelectron.，2017，87： 96-100

23?Qian Y，Karpus J，Kabil O，Zhang S Y，Zhu H L，Banerjee R，Zhao J，He C. Nat. Commun.，2011，2： 495

24?Chen Y C，Zhu C C，Yang Z H，Chen J J，He Y F，Jiao Y，He W J，Qiu L，Cen J J，Guo Z J. Angew. Chem. Int. Ed.，2013，52（6）： 1688-1691

25?ZHONG Ke-Li，ZHAO Jie，LI Qiu-Ying，HOU Shu-Hua，TANG Yi-Wei，BIAN Yan-Jiang，TANG Li-Jun. Chin. J. Org. Chem.，2018，38（7）： 1786-1791

鐘克利，趙 杰，李秋瑩，侯淑華，湯軼偉，邊延江，湯立軍. 有機化學(xué)，2018，38（7）： 1786-1791

26?Wei C，Wei L，Yi L，Xi Z. Tetrahedron Lett.，2013，54（50）： 6937-6939

27?Hammers M D，Pluth M D. Anal. Chem.，2013，86（14）： 7135-7140

28?Zhang C Y，Wei L，Wei C，Zhang J，Wang R Y，Xi Z，Yi L. Chem. Commun.，2015，51（35）： 7505-7508

29?Ma C，Wei C，Li X Y，Zheng X Y，Chen B，Wang M，Zhang P Z，Li X L. Dyes Pigments，2019，162： 624-631

30?Wei C，Wang R Y，Zhang C Y，Xu G C，Li Y Y，Zhang Q Z，Li L Y，Yi L，Xi Z. Chem. Asian J.，2016，11（9）： 1376-1381

31?Jia X，Li W，Guo Z H，Guo Z B，Li Y，Zhang P Z，Wei C，Li X L. Chemistryselect，2019，4（29）： 8671-8675

32?Zhang J，Wang R Y，Zhu Z T，Yi L，Xi Z. Tetrahedron，2015，71（45）： 8572-8576

33?Ozdemir T，Sozmen F，Mamur S，Tekinay T，Akkaya E U. Chem. Commun.，2014，50（41）： 5455-5457

34?Xu Z Y，Wu Z Y，Tan H Y，Yan J W，Liu X L，Li J Y，Xu Z Y，Dong C Z，Zhang L. Anal. Methods，2018，10（27）： 3375-3379

35?Fang T，Jiang X D，Sun C L，Li Q. Sens. Actuators B，2019，290： 551-557

36?Zinchuk V，Zinchuk O. Prog. Histochem. Cyto.，2009，44： 125-172