王荻，孫偉，陸紹霞，李紹戊，曹永生，盧彤巖，劉紅柏

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱 150006）

21 世紀(jì)以來，我國(guó)魚類養(yǎng)殖技術(shù)快速發(fā)展，已逐漸步入工業(yè)化、集約化、規(guī)?；默F(xiàn)代化養(yǎng)殖新時(shí)期[1]。但水環(huán)境惡化、養(yǎng)殖魚類病害頻發(fā)等一系列問題嚴(yán)重制約了我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速健康發(fā)展。魚類寄生蟲病是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)病率最高的疾病[1]，且寄生蟲的損傷還是細(xì)菌性體表病發(fā)生和流行的主要原因[2]。20 世紀(jì)50 年代初，中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所成立魚類寄生蟲研究組，率先對(duì)青魚、草魚、鰱、鳙四大家魚的寄生蟲進(jìn)行了研究。隨后，我國(guó)研究人員在魚類寄生蟲鑒定、流行規(guī)律、病理、防治等方面開展了大量的研究工作[1]。

魚類寄生蟲種類繁多，其中粘孢子蟲Myxosporidia 是一類在世界范圍內(nèi)廣泛分布的[3,4]后生動(dòng)物寄生蟲[5]，主要寄生于魚體各組織和腔內(nèi)。迄今已發(fā)現(xiàn)的粘孢子蟲共有62 屬2 180 余種[6]。20 世紀(jì)60 年代，我國(guó)已有粘孢子蟲的研究報(bào)道[7]，但直至20 世紀(jì)末粘孢子蟲分類鑒定仍只能靠肉眼和顯微鏡觀察[8,9]和經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行傳統(tǒng)分類。粘孢子蟲體形微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、種類繁多、形態(tài)相似，單一的形態(tài)學(xué)鑒定和系統(tǒng)分類極易出現(xiàn)偏差[10]。DNA 序列差異是生物體間最本質(zhì)的差別[11]，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展應(yīng)用及其技術(shù)的不斷拓新成熟，分子系統(tǒng)學(xué)方法、分子標(biāo)記、關(guān)鍵種分子數(shù)據(jù)等逐步應(yīng)用于具有細(xì)微差異的物種間的鑒定[12-14]。20 世紀(jì)90 年代初，18S rDNA 首次作為分子標(biāo)記開始用于粘孢子蟲系統(tǒng)分類[15]。18S rDNA 擴(kuò)增片段為生物中最為保守的基因之一，長(zhǎng)度適中、信息充足、容易獲得[16]，在粘孢子蟲分類學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用，解決或修正了大量經(jīng)典分類中存在的爭(zhēng)議問題[12]。

目前，我國(guó)對(duì)冷水魚寄生蟲的研究極少，大西洋鮭源寄生蟲的相關(guān)研究尚未報(bào)道。本文通過對(duì)一種大西洋鮭源的寄生蟲進(jìn)行分離觀察和鑒定，以豐富冷水魚寄生蟲的研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源與蟲種觀察

觀察樣本為購(gòu)自水產(chǎn)品市場(chǎng)的野生樣本，經(jīng)鑒定為大西洋鮭Salmo salar，體長(zhǎng)55cm，體質(zhì)量為2.3kg。標(biāo)本的處理、觀察、測(cè)量和辨別方法以及所用術(shù)語參照趙元莙等的文獻(xiàn)報(bào)道[17]。

1.2 樣品18S rDNA 片段擴(kuò)增及序列測(cè)定

1.2.1 基因組DNA 的制備

粘孢子蟲裂解液的配置：NaCl 0.585g、Tris-base 0.121g、SDS 0.2g、蛋白酶20mg，加入蒸餾水定容至100mL。

用鑷子將寄生蟲孢囊從寄主肌肉中取出，置于盛有滅菌蒸餾水的平皿中，刺破孢囊將孢子分散于水中，吸取孢子懸液至1.5mL 離心管中，4 000r/min離心10min，蒸餾水重懸，重復(fù)離心洗滌一次用以去除雜質(zhì)。取少量去除雜質(zhì)的孢子，加入250μL 無菌蒸餾水，向離心管中加350μL 孢子蟲裂解液，50℃恒溫水浴2h 后，采用常規(guī)的苯酚-氯仿抽提方法提取寄生蟲孢子基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 目的片段擴(kuò)增及序列測(cè)定

選用特異性引物[18]，擴(kuò)增樣本DNA 中18S rDNA 目的片段。引物序列分別為ERIB-1：5’-ACCT GGTTGATCCTGCCAG-3’和ERIB-10：5’-CTTC-CG CAGGTTCACCTACGG-3’。25μL 的PCR 反應(yīng)體系中包括：DNA 模板1μL，上下游引物各0.5μL（10 μmol/L），PremixTaq Version 2.0（含有TaKaRa Taq 1.25 U/μL；dNTP Mixture 各0.4 mM；PCR Buffer 含3 mM Mg2+）12.5μL，加水補(bǔ)足至25μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延 伸2min，循 環(huán)35 次；72℃后 延 伸10min，反應(yīng)完成后4℃保溫。取5μL 擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至吉林庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育

將測(cè)序所得序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)已有序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用MEGA7.0 軟件比對(duì)和編輯所得序列,計(jì)算遺傳距離，并自舉檢驗(yàn)（重復(fù)1 000 次）拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，獲得進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)觀察

在大西洋鮭肌肉樣本中肉眼可見大量蟲體聚集在一起形成的孢囊。孢囊直徑約3～5mm，乳白色，由結(jié)締組織膜包裹（圖1-A）；鏡檢發(fā)現(xiàn)，蟲體呈倒卵形或紡錘形；殼瓣光滑，無褶皺，殼片向后延長(zhǎng)成針狀尾突，分開或并攏，縫脊直而明顯，孢質(zhì)中隱約可

圖1 大西洋鮭肌肉樣本中尾孢蟲（Henneguya sp.）的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.1 Morphological structure of Sporozoan Henneguya in muscle samples of Atlantic salmon

見嗜碘泡和圓形胚核（圖1-B）。

2.2 18S rDNA 基因片段序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究得到的大西洋鮭源寄生蟲18S rDNA 基因片段序列命名為HLJ，長(zhǎng)度為1 338 個(gè)核苷酸（nt），其序列信息如圖2 所示，并已上傳至Gen-Bank,登錄號(hào)為MK774672。

圖2 大西洋鮭肌肉樣本中尾孢蟲（Henneguya sp.）的18S rDNA 片段序列Fig.2 Sequence of 18S rDNA gene fragment of Sporozoan Henneguya in muscle samples of Atlantic salmon

表1 基于18S rDNA 的遺傳距離Tab.1 Genetic distances based on 18S rDNA

所得序列堿基含量為：A=27.88%，T=28.25%，G=26.46%，C=17.41%，表現(xiàn)為AT 含量豐富模式（AT-rich pattern）。以Polypodium hydriforme 為外群，與GenBank 上已有的40 個(gè)尾孢子蟲屬Henneguya 及2 個(gè)碘泡蟲屬M(fèi)vxobolus 寄生蟲相應(yīng)序列片段比對(duì)，經(jīng)計(jì)算構(gòu)建的進(jìn)化樹如圖3 所示。

結(jié)果表明：所得18S rDNA 基因片段序列與登錄號(hào)為AF378344.1 的楚氏尾孢蟲H.zschokkei 和登錄號(hào)為AF031411 的鮭居尾孢蟲H.salminicola 的同源性最高，分別為98.7%和97.4%；這三個(gè)序列與尾孢子蟲屬的另外3個(gè)種（H.cutanea、H.zikaweiensis、H.doneci）及碘孢蟲屬的M.neurotropus 和M.arcticus 聚為一支。

選取進(jìn)化樹中同一分支上的9 個(gè)序列進(jìn)行遺傳距離分析，結(jié)果表明：H.zschokkei 與所得到的HLJ之間遺傳距離最小，為0.0098，而其他不同種間的遺傳距離均＞0.01。

3 討論

引發(fā)粘孢子蟲病的尾孢蟲屬寄生蟲在我國(guó)養(yǎng)殖魚類中已有所報(bào)道，如感染鱖Siniperca chuatsi Basilewsky、鯽Carassius auratus 鰓部的由宿主增生結(jié)締組織形成孢囊的多格里尾孢蟲H.doneci[6,19]；寄生于鄱陽湖水域鯽鰓部的徐家匯尾孢蟲H.zikawiensis[12]等。目前為止，國(guó)內(nèi)報(bào)道多集中于鱖、鯽等魚類鰓部寄生蟲，尚未見冷水魚感染尾孢蟲的報(bào)道。

圖3 基于18S rDNA 的尾孢子蟲及其相關(guān)類群的NJ 進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Henneguya and relevant taxabased on 18S rDNA sequences data

而本研究發(fā)現(xiàn)的寄生蟲在大西洋鮭肌肉中形成大量乳白色孢囊，經(jīng)18S rDNA 序列測(cè)定比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與Kent 報(bào)道[10]的寄生于加拿大哥倫比亞山地柱白鮭Prosopium williamsoni 體內(nèi)的楚氏尾孢蟲同源性最高，高達(dá)98.7%，且遺傳距離僅為0.0098。而冉佼等[4]通過基于18S rDNA 序列對(duì)粘孢子蟲遺傳距離的比較研究發(fā)現(xiàn)，粘孢子蟲種內(nèi)遺傳距離為0～0.042，多集中于0～0.007 之間；而種間遺傳距離為0.01～0.323，大部分集中于0.1342～0.1978 之間。本研究比較分析了進(jìn)化樹中分支最近的9 個(gè)序列的遺傳距離，還發(fā)現(xiàn)除同種H.doneci 間遺傳距離為0.0022 外，其他種間遺傳距離均大于0.01，與冉佼等計(jì)算的結(jié)果一致。因而，判定本研究所檢測(cè)的寄生蟲為楚氏尾孢蟲。

在進(jìn)化樹中，楚氏尾孢蟲、鮭居尾孢蟲聚成一支后與尾孢子蟲屬的H.cutanea、H.zikaweiensis、H.doneci 和碘孢蟲屬的M.neurotropus、M.arcticus 形成一個(gè)大的聚類，這樣的結(jié)果與魯義善等[20]的研究結(jié)果相同，表明碘孢蟲和尾孢蟲遺傳距離較小，可能不是單系進(jìn)化，僅通過單一的分子生物學(xué)方法對(duì)兩個(gè)屬進(jìn)行區(qū)分缺乏一定的準(zhǔn)確性，應(yīng)輔以形態(tài)學(xué)觀察等方法進(jìn)行綜合鑒定。尾孢蟲與碘孢蟲形態(tài)學(xué)最大差異是具有尾突。而種內(nèi)和屬內(nèi)種間遺傳距離在一定范圍內(nèi)有重疊，表明物種之間的遺傳距離可能并不存在絕對(duì)的界限[4]。基因序列之間的分歧程度與物種的形成過程密切相關(guān)[19]。遺傳距離受物種分化歷史長(zhǎng)短的影響較大，也存在鑒定方法誤差問題。因而，要了解掌握我國(guó)冷水魚寄生蟲病的發(fā)生流行規(guī)律，準(zhǔn)確鑒定病原仍需進(jìn)行大量流行病學(xué)調(diào)查和數(shù)據(jù)收集整理工作。