白海鑫　劉小花　陳華梅

摘要：基于吸光度的加和性原理，在選定波長254、224 nm下，通過對(duì)苯甲酸/山梨酸的吸光度與濃度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸分析所得的斜率，建立了苯甲酸和山梨酸吸光度D與濃度C的關(guān)系方程組，最終獲得起1種無需分離即可同時(shí)測定食品中的苯甲酸和山梨酸含量的方法。結(jié)果表明：苯甲酸的回收率為91.83%～102.10%，RSD（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）為0.885%，最小檢出限為0.13 mg/L，山梨酸的回收率為91.81%～92.67%，RSD為3.01%，最小檢出限為0.096 mg/L，除了具有成本低、操作簡單、快速、高效、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)外，該方法最大的優(yōu)點(diǎn)是可不經(jīng)分離而直接測定混合樣品中的苯甲酸與山梨酸的濃度。

關(guān)鍵詞：吸光光度法;同時(shí)測定;苯甲酸;山梨酸

中圖分類號(hào)： TS255.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）19-0224-03

收稿日期：2018-07-21

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31501213）;河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃（編號(hào)：2014GGJS-083）。

作者簡介：白海鑫（1973—），男，河南中牟人，博士，副教授，主要從事吸收光譜及熒光光譜的分析方法研究。E-mail：haixin_bai@aliyun.com。

通信作者：劉小花，博士，副教授，主要從事光譜分析與材料化學(xué)方面的研究。E-mail：xiaohualiu78@aliyun.com。

科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展使食品工業(yè)快速崛起，食品添加劑得以廣泛應(yīng)用。部分商家為追求食品的色、香、味俱全，延長保質(zhì)期，往往會(huì)在食品中添加大量食品添加劑?！妒称诽砑觿┦褂眯l(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)食品添加劑用量和使用范圍都有嚴(yán)格的規(guī)定和要求[1]。但仍有廠家為了降低生產(chǎn)成本和延長保質(zhì)期等，在食品中加入過量食品添加劑，而食品添加劑攝入過量會(huì)危及人體健康。苯甲酸和山梨酸是較常用的食品添加劑，它們?cè)谑称分泻康臏y定方法的研究顯得尤其重要。測定苯甲酸和山梨酸含量的方法有氣相色譜法[2-3]、高效液相色譜法[4-6]、薄層色譜法[7]、滴定法[8]、吸光光度法[9-10]。雖然氣相色譜法和高效液相色譜法被較多地用于食品中苯甲酸與山梨酸的測定，但其儀器昂貴，分析成本高和操作繁雜等，不利于其應(yīng)用與普及。鑒于吸光光度法操作簡單、快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)[11-13]，本研究通過對(duì)不同選定波長下的吸光度與濃度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸分析，并基于吸光光度法中吸光度具有加和性原理建立了對(duì)樣品中的苯甲酸和山梨酸不經(jīng)分離而直接同時(shí)測定的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

分析純級(jí)的苯甲酸和山梨酸購自上海阿拉丁試劑有限公司;其余試劑均為分析純。試驗(yàn)用水為去離子水，試驗(yàn)用山楂片購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

吸收光譜及光度分析試驗(yàn)所用分光光度儀系配有1 cm光程的石英比色皿的TU-1901型雙光束紫外可見光譜儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 苯甲酸及山梨酸溶液的配制

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的苯甲酸，用5% Na2HPO4或0.01 mol/L NaOH溶液溶解，定容為1 mg/mL苯甲酸溶液儲(chǔ)備液，用時(shí)稀釋到所需濃度;山梨酸溶液的配制方法與此相同。

1.3 食品樣品的預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量研碎的山楂片于適量蒸餾水中，超聲提取20 min，離心，過濾，將濾液轉(zhuǎn)入容量瓶并用蒸餾水定容。取部分濾液于分液漏斗中，加入一定量HCl及飽和NaCl溶液，用乙醚萃取4次，棄無機(jī)相，合并有機(jī)相于另一分液漏斗中，再用5% Na2HPO4溶液進(jìn)行反萃取多次，棄有機(jī)相，合并無機(jī)相于小燒杯中[14]。在70 ℃磁力攪拌下去除乙醚，將去除乙醚的溶液轉(zhuǎn)入容量瓶中，用5% Na2HPO4溶液定容。以試劑空白為參比溶液，在200～300 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，測定樣品的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑的選擇

苯甲酸和山梨酸微溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。常用 0.01 mol/L? NaOH溶液溶解苯甲酸和山梨酸[10，15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在室溫下用0.01 mol/L NaOH溶液溶解苯甲酸和山梨酸至少要攪拌15 min，放置時(shí)間長，且有白色渾濁沉淀生成;當(dāng)用5% Na2HPO4溶解苯甲酸和山梨酸時(shí)，溶解時(shí)間較短，不需攪拌，立即溶解。

從苯甲酸和山梨酸在0.01 mol/L NaOH和5% Na2HPO4溶液中的吸收光譜可看出，苯甲酸和山梨酸在5% Na2HPO4和0.01 mol/L NaOH溶液中的吸收光譜基本相同，苯甲酸和山梨酸的最大吸收峰無明顯變化（圖1、圖2），該試驗(yàn)結(jié)果表明，苯甲酸和山梨酸的吸收光譜不受這些溶劑的影響。在提取食品樣品中的苯甲酸和山梨酸時(shí)，一般是先酸化樣品，再用乙醚萃取有機(jī)物質(zhì)，最后用5% Na2HPO4溶液反萃取并定容[14]。綜合考慮苯甲酸的溶解性及后續(xù)試驗(yàn)等因素，本試驗(yàn)選用5% Na2HPO4溶液作為溶解苯甲酸和山梨酸的溶劑。

2.2 測定波長的選擇

準(zhǔn)確移取一定量的儲(chǔ)備液，以5% Na2HPO4溶液為溶劑分別測定10 mg/L苯甲酸和4 mg/L山梨酸溶液在200～300 nm 范圍內(nèi)的吸收光譜。由圖3可知，苯甲酸、山梨酸的最大吸收波長分別為224、254 nm。苯甲酸和山梨酸在200～300 nm波長范圍具有較強(qiáng)的吸收，光譜重疊。由于兩者的吸收光譜雙向重疊，互相干擾，因此不能直接利用吸光度D與濃度C的關(guān)系對(duì)苯甲酸和山梨酸進(jìn)行單組分測量，在該范圍內(nèi)測得的吸光度均為苯甲酸與山梨酸吸光度之和。如苯甲酸、山梨酸在224、254 nm處的吸光度可表示為下式：

D224，x+y=k224，xCx+k224，yCy;

D254，x+y=k254，xCx+k254，yCy。

式中：x、y分別指苯甲酸與山梨酸。上式中濃度項(xiàng)的4個(gè)系數(shù)k可通過苯甲酸與山梨酸單獨(dú)存在時(shí)相應(yīng)波長下的吸光度D與濃度C的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率求得，將4個(gè)k值代入上方程組即可求出苯甲酸與山梨酸的濃度。苯甲酸與山梨酸在224、254 nm處均有一定的靈敏度，故本試驗(yàn)選擇在224、254 nm 處進(jìn)行苯甲酸與山梨酸單獨(dú)存在時(shí)吸光度D與濃度C的標(biāo)準(zhǔn)曲線測定及二者共存時(shí)的吸光度的測定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)

準(zhǔn)確移取苯甲酸或山梨酸儲(chǔ)備液，加入5% Na2HPO4溶液，分別配成一系列準(zhǔn)確濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其吸收光譜，取224、254 nm處的D224 nm、D254 nm對(duì)濃度C作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4至圖7），并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合以求得其線性回歸方程及斜率。

由圖4及圖5可知，苯甲酸在254 nm處吸光度D254 nm對(duì)濃度C的線性回歸方程為D254 nm=0.006 35C苯甲酸-0.002 29，相關(guān)系數(shù)r=0.989 3，線性范圍為0.00～30.00 mg/L。山梨酸在254 nm處的線性回歸方程為D254 nm=0.250 87C山梨酸-0.007 69，相關(guān)系數(shù)r=0.998 6，線性范圍為0.00～8.00 mg/L。由于吸光度具有加和性，所以二者共存的樣品溶液在254 nm處的吸光度如下：

D_{254 nm}=0.250 87C_山梨酸+0.006 35C_苯甲酸-0.009 98。（1）

同理，由圖6及圖7可知，苯甲酸在224 nm處的線性回歸方程為D224 nm=0.070 38C苯甲酸-0.009 64，相關(guān)系數(shù)r=0.998 6，線性范圍為0.00～30.00 mg/L。山梨酸在224 nm處的線性回歸方程為D224 nm=0.080 38C山梨酸+0.014 36，相關(guān)系數(shù)r=0.991 0，線性范圍為0.00～8.00 mg/L。因此，苯甲酸與山梨酸混合樣品溶液在224 nm處的吸光度如下：

D_{224 nm}=0.080 38C_山梨酸+0.070 38C_苯甲酸+0.004 72。（2）

由上述標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)可知，在其線性范圍內(nèi)，苯甲酸和山梨酸在224、254 nm處的吸光度D與濃度C之間有著良好的線性關(guān)系。對(duì)于苯甲酸與山梨酸混合樣品，可通過測定混合樣品在224和254 nm處的吸光度D，聯(lián)立得方程組：

D_{254 nm}=0.250 87C_山梨酸+0.006 35C_苯甲酸-0.009 98;（3）

D_{224 nm}=0.080 38C_山梨酸+0.070 38C_苯甲酸+0.004 72。（4）

求解該方程組，即可不經(jīng)分離求得苯甲酸和山梨酸的混合樣品中各自濃度。鑒于試驗(yàn)測定時(shí)一般選擇200～300 nm波長下的吸光度D=0.434為試驗(yàn)測值，此時(shí)光度法誤差最小。然而，該方程組中常數(shù)項(xiàng)（0.009 98及0.004 72）數(shù)值相對(duì)于0.434的相對(duì)誤差小于光度法的最小誤差（約為2.7%）。因此方程組中的常數(shù)項(xiàng)在準(zhǔn)確度要求不太高的計(jì)算中可忽略，故以上方程組可簡化為下式：

D_{254 nm}=0.250 87C_山梨酸+0.006 35C_苯甲酸;（5）

D_{224 nm}=0.080 38C_山梨酸+0.070 38C_苯甲酸。（6）

3 討論

3.1 樣品測定

準(zhǔn)確移取5.00 mL山楂樣品溶液，按預(yù)處理方法處理樣品溶液，在相同條件下，平行測定6次樣品溶液，計(jì)算苯甲酸和山梨酸含量以及它們的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（%）。

由表1可知，苯甲酸的RSD為0.885%，在線性范圍有較好的精密度，山梨酸的RSD為3.01%，在線性范圍內(nèi)，精密度低于苯甲酸。

3.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

分別用苯甲酸和山梨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制不同濃度的混合液，每種濃度進(jìn)行6次平行測定試驗(yàn)，將測得的吸光度代入回歸方程，測定值與理論值之比即為回收率。苯甲酸的回收率為91.83%～102.10%，山梨酸的回收率為91.81%～92.67%，回收率符合試驗(yàn)要求，分析方法具有良好的準(zhǔn)確度。

4 結(jié)論

本研究基于吸光光度法中吸光度具有加和性，通過對(duì)不同選定波長下的吸光度與濃度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸分析所得的斜率，建立了苯甲酸和山梨酸在波長254、224 nm下的吸光度D與濃度C的關(guān)系方程組：

D_{254 nm}=0.250 87C_山梨酸+0.006 35C_苯甲酸;

D_{224 nm}=0.080 38C_山梨酸+0.070 38C_苯甲酸。

通過測定苯甲酸與山梨酸混合樣品在上述2個(gè)波長處的吸光度D，并代入該方程組即可直接求出樣品中苯甲酸與山梨酸的濃度。結(jié)果表明，苯甲酸的線性范圍為0.00～30.00 mg/L，最小檢出限為0.13 mg/L，山梨酸的線性范圍為0.00～8.00 mg/L，最小檢出限為0.096 mg/L，該方法得到苯甲酸的回收率為91.83%～102.1%，RSD為0.885%，山梨酸的回收率為91.81%～92.67%，RSD為3.01%。該方法除操作簡單、快速、高效外，最大的優(yōu)點(diǎn)就是無需分離苯甲酸與山梨酸就可測定二者共存樣品中各自的濃度。鑒于大多數(shù)食品中的添加劑都不止1種，而是2種或多種添加劑共存，故本方法的建立對(duì)測定食品中添加劑含量具有較大借鑒意義。

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