莊娟　單群　張子峰　徐建明　鄭元林

摘要：主要探討了持續(xù)性有機環(huán)境污染物2，2′，4，4′-四溴聯(lián)苯醚（2，2′，4，4′-tetrabromodiphenyl ether，BDE-47）對小鼠肝腎和腦組織氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的毒性效應(yīng)。將C57BL/6J小鼠分為4組，即對照組小鼠灌胃玉米油，低劑量組、中劑量組和高劑量組為對小鼠分別灌胃10、20、40 mg/kg BDE-47，每天處理1次，4、6、8周后稱肝腎和腦組織濕質(zhì)量并計算臟器系數(shù)，測定染毒8周后的小鼠肝腎和腦組織活性氧水平及炎癥因子IL-6和TNF-α的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BDE-47可造成肝臟臟器系數(shù)增大，腎臟和腦臟器系數(shù)減小，BDE-47可促進肝腎和腦組織活性氧堆積，炎癥因子IL-6和TNF-α表達增強，這可能是造成這些組織損傷的重要機制。

關(guān)鍵詞：BDE-47;肝臟;腎臟;腦;臟器系數(shù);氧化應(yīng)激;炎癥反應(yīng);基因表達

中圖分類號： X174文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0302-05

收稿日期：2018-07-09

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：81171012、81570531、31200873）;江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程（編號：PPZY2015A018）;江蘇省高校自然科學(xué)基金（編號：18KJB330001）。

作者簡介：莊 娟（1977—），女，江蘇南通人，博士，講師，主要從事環(huán)境毒理研究。E-mail：dajiangsky@163.com。

通信作者：鄭元林，博士，教授，主要從事抗衰老的分子生物學(xué)機制研究。E-mail：zhengyl@jsnu.edu.cn。

多溴聯(lián)苯醚（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）是一類重要的溴代阻燃物，廣泛應(yīng)用于電子設(shè)備、紡織品、塑料及建筑裝潢材料中。PBDEs具有高脂溶性，降解周期長，生物蓄積性強，是一類潛在的持久性有機污染物（persistent organic pollutants，POPs）[1]。因為PBDEs與載體之間以非化學(xué)鍵相連，因此在使用和處置過程中，PBDEs會從產(chǎn)品中釋放到環(huán)境介質(zhì)中[2]，可通過飲食、吸入和皮膚接觸進入機體[3-4]。PBDEs含有209種同源物，其中BDE-47分布最廣，在環(huán)境和人體樣本中都有較高的檢測水平[5-6]。毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，較其他PBDEs，BDE-47在體內(nèi)代謝周期長，生物蓄積性更強[7]，因此BDE-47的毒作用及毒性機制受到越來越多的關(guān)注。筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)，BDE-47可造成肝腎和腦組織損傷[8-10]，但具體的機制尚不清楚。

臟器系數(shù)是毒理學(xué)試驗評價外源化學(xué)物對動物臟器受損的一項常用指標(biāo)[8，11]，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是造成組織損傷的重要機制[12-13]，本試驗采用10、20、40 mg/kg BDE-47對小鼠進行灌胃染毒，探究BDE-47對小鼠肝腎和腦組織臟器系數(shù)、氧化狀態(tài)和炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

7周齡C57BL/6J小鼠40只，購于北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)在溫度為（22±1） ℃、濕度為（50±10）%、12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境中，自由進水和食物。

1.2 試劑

BDE-47純度大于99%，購于美國Chem. Service Inc.;活性氧測定試劑盒OxiSelectTM In Vitro ROS/RNS Assay Kit購于美國Cell Biolabs Inc.;Trizol試劑盒購至美國Invitrogen;TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR預(yù)混Ex Taq購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 方法

BDE-47按相應(yīng)染毒劑量溶解于玉米油。8周齡C57BL/6J小鼠分為4組，即玉米油對照組、低劑量組（10 mg/kg BDE-47）、中劑量組（20 mg/kg BDE-47）和高劑量組（40 mg/kg BDE-47），小鼠每天按相應(yīng)劑量灌胃1次，連續(xù)灌胃4、6、8周，小鼠禁食過夜，于次日09：00—10：00間稱體質(zhì)量，麻醉并頸椎脫臼處死，迅速取出肝腎和腦組織并稱質(zhì)量，計算臟器系數(shù)（臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/空腹體質(zhì)量×100%，每組統(tǒng)計4～6個樣本）。所有試驗在2015—2016年于江蘇師范大學(xué)江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點實驗室開展。

1.4 活性氧含量檢測

活性氧（ROS）含量的測定方法按試劑盒說明書進行。小鼠在麻醉后冰上取出肝腎和腦組織，加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH值7.2），低溫超聲勻漿后于4 ℃下以10 000 g轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清，測定活性氧含量。激發(fā)光波長 484 nm 和發(fā)射波長530 nm測定DCF的數(shù)量，根據(jù)DCF標(biāo)準(zhǔn)曲線進行樣本ROS定量，表示為1 min 1 μg組織蛋白提取液生成的DCF量（nmol）。

1.5 定量實時聚合酶鏈反應(yīng)

Trizol試劑盒購提取各組小鼠肝腎和腦組織總RNA，采用紫外分光光度法進行RNA定量。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，取1 μg RNA為模板用于反轉(zhuǎn)錄互補DNA。TNF-α引物（5′-3′），CCAGACCCTCACACTCAGATCATC，引物（3′-5′），CCTTGAAGAGAACCTGGGAGTAGAC;IL-6引物（5′-3′），GTCCTTCCTACCCCAATTTCCAA，引物（3′-5′），GAATGTCCACAAACTGATATGCTTAGG。GAPDH為內(nèi)參，均由生工生物（上海）股份有限公司合成。使用TaKaRa SYBR預(yù)混Ex Taq進行熒光定量實時PCR，每個樣本設(shè)3個平行，檢測mRNA含量。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，試驗數(shù)據(jù)采用One-Way ANOVA進行單因素方差分析，Tukeys顯著性分析，其中P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BDE-47對C57BL/6小鼠體質(zhì)量及一般狀況的影響

試驗期間各組動物飲食、飲水等狀況未見明顯異常，動物無死亡。染毒4周，高劑量組小鼠活動性變差，皮毛凌亂，毛發(fā)無光澤;染毒6周，中劑量組小鼠皮毛光澤度變差。處理4、6、8周后對小鼠禁食后稱質(zhì)量，結(jié)果（表1）表明，BDE-47暴露對小鼠體質(zhì)量無顯著影響。

2.2 BDE-47對小鼠肝腎和腦組織質(zhì)量的影響

處理4、6、8周后對小鼠進行解剖，各組小鼠腎臟和腦組織外觀正常。染毒8周，高劑量組有3只小鼠肝臟表面可見灰白色斑點。隨著BDE-47染毒劑量增大和染毒時間延長，解剖可見小鼠肝臟變大，雙腎或單腎變小，腦組織變小。

2.2.1 肝臟濕質(zhì)量及臟器系數(shù)

各組小鼠平均肝臟濕質(zhì)量和臟器系數(shù)見表2和表3。染毒4周，與對照組相比，高劑量 BDE-47造成肝臟濕質(zhì)量和臟器系數(shù)顯著增加;染毒6周，與對照組相比，中劑量組、高劑量組小鼠肝臟質(zhì)量和臟器系數(shù)分別在0.05、0.01水平上顯著提高;隨著染毒時間延長，肝臟增大現(xiàn)象更為嚴(yán)重，即染毒8周，中劑量組、高劑量組分別在0.01、0.001水平上顯著提高。

2.2.2 腎臟濕質(zhì)量及臟器系數(shù)

各組小鼠腎臟濕質(zhì)量和臟器系數(shù)見表4和表5。染毒4周，BDE-47中劑量組小鼠雙腎組織濕質(zhì)量降低，高劑量組小鼠雙腎組織濕質(zhì)量增加，但與對照組相比差異均不顯著;染毒8周，與對照組相比，BDE-

47高劑量組小鼠雙腎組織濕質(zhì)量和臟器系數(shù)分別在0.01、0.05水平上顯著降低。

2.2.3 腦濕質(zhì)量及腦臟器系數(shù)

表6顯示，染毒4周，各組小鼠平均腦濕質(zhì)量無顯著差異。隨著染毒時間延長和染毒劑量增加，小鼠腦平均濕質(zhì)量降低。其中，與對照組相比，染毒6周的高劑量組小鼠腦濕質(zhì)量在0.01水平上顯著降低;染毒8[CM（25*8]周，中劑量組、高劑量組分別在0.05、0.001水平上顯著降低。進一步統(tǒng)計腦臟器系數(shù)，其結(jié)果見表7。染毒6周，造成小鼠腦臟器系數(shù)下降，但與對照組相比差異不顯著。染毒8周，與對照組相比，中劑量組、高劑量組小鼠腦臟器系數(shù)分別在0.05、0.01水平上顯著降低。

2.3 BDE-47對小鼠肝腎和腦組織活性氧含量的影響

染毒8周后，檢測各組小鼠肝臟、腎臟和腦組織活性氧（ROS）含量，結(jié)果見圖1。與對照組相比，低劑量BDE-47對小鼠肝腎和腦組織ROS含量影響不顯著;中劑量組小鼠肝臟和腦組織ROS顯著堆積（P<0.001）;高劑量組小鼠肝腎和腦組織ROS含量顯著增加（P<0.001）。

2.3 BDE-47對小鼠肝腎和腦組織IL-6和TNF-α基因表達的影響

染毒8周后，檢測各組小鼠肝腎和腦組織進行IL-6和TNF-α基因表達情況，結(jié)果見圖2。與對照組相比，低劑量BDE-47對小鼠肝腎和腦組織IL-6和TNF-α基因表達影響不顯著。隨著BDE-47暴露劑量增加，與對照組相比，IL-6和TNF-α基因在肝臟組織（中劑量組、高劑量組在 0.01 水平）、腎臟組織（高劑量組在0.001水平）和腦組織（IL-6，中劑量組、高劑量組在0.05、0.01水平;TNF-α，低劑量組、高劑量組在0.01）中表達顯著增加。

3 討論與結(jié)論

早期研究者使用 14C標(biāo)記的方式檢測了BDE-47灌胃后在小鼠和大鼠機體內(nèi)的分布情況。結(jié)果顯示，BDE-47主要分布于脂肪組織，其次是肝腎等組織。此外，BDE-47可以通過血腦屏障分布至腦[14-15]。經(jīng)檢測，浙江電子垃圾拆解區(qū)癌癥患者肝腎組織中含有較高的BDE-47[16]。該地區(qū)居民腎損傷分子β2微球蛋白含量和BDE-47呈正相關(guān)[17]。此外，尸檢腦樣本中可檢測出7種PBDEs，其中BDE-47含量最高[18]。這些試驗結(jié)果說明BDE-47可影響肝腎和腦組織。

本試驗結(jié)果表明，BDE-47可影響肝腎和腦組織。臟器系數(shù)常被用來評價外源化學(xué)物對動物臟器的損害[8]。慢性BDE-47暴露可造成小鼠肝臟質(zhì)量增加，臟器系數(shù)增加;腎臟和腦組織質(zhì)量減少，臟器系數(shù)減小。筆者之前的試驗發(fā)現(xiàn)，8周齡ICR小鼠接受150 mg/kg BDE-47處理12周后出現(xiàn)肝臟氧化損傷，肝臟臟器系數(shù)增加[19]。與本試驗結(jié)果相比，染毒劑量大，說明C57BL/6小鼠的肝臟對BDE-47影響的敏感性較強。目前還沒有文獻報道BDE-47對腎臟臟器系數(shù)的影響。筆者發(fā)現(xiàn)，40 mg/kg BDE-47處理8周后可引起小鼠雙腎濕質(zhì)量和臟器系數(shù)下降;但與肝臟相比，引起腎臟濕質(zhì)量變化的BDE-47劑量大，作用時間長;此外，BDE-47導(dǎo)致腦組織濕質(zhì)量減輕的有效劑量為20 mg/kg，且須處理8周，說明不同組織對BDE-47反應(yīng)存在差異。

雖然BDE-47的毒性機理尚不清楚，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是BDE-47引起組織損傷的一個重要原因[20]。氧化應(yīng)激與細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高有關(guān)。Reistad等首次報道了BDE-47會引起人中性粒細(xì)胞ROS含量升高[21]。ROS是細(xì)胞有氧代謝的副產(chǎn)物，當(dāng)ROS含量水平超過細(xì)胞抗氧化能力時就會對細(xì)胞產(chǎn)生毒害，造成細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和膜脂損傷。本研究進一步的檢測結(jié)果顯示，BDE-47可造成肝腎和腦組織ROS堆積，肝臟和腦組織對BDE-47誘導(dǎo)的氧化壓力較腎臟組織敏感。筆者之前發(fā)現(xiàn)，150 mg/kg BDE-47處理12周可造成ICR小鼠肝臟氧化損傷[8]。而本試驗誘導(dǎo)肝臟氧化應(yīng)激所需的BDE-47劑量小、時間短，該結(jié)果與BDE-47對小鼠臟器系數(shù)的影響一致，進一步說明了C57BL/6J小鼠肝臟對BDE-47具有較強的敏感性。之前的文獻報道，小鼠出生后第10天接受10 mg/kg BDE-47灌胃處理后，腦組織會出現(xiàn)氧化應(yīng)激[20]。代謝動力學(xué)的證據(jù)表明，乳鼠BDE-47的代謝能力較成年鼠差，并且發(fā)育中的腦組織對外源化學(xué)物的敏感性較強[7]。因此，本研究中引起腦組織氧化應(yīng)激的BDE-47有效劑量相對較高，為20 mg/kg。

炎癥反應(yīng)在外源化學(xué)物造成組織損傷中扮演重要角色[22]，當(dāng)氧化壓力增強時會引發(fā)炎癥反應(yīng)[23]。體外試驗證明，BDE-47可誘導(dǎo)人早孕絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo炎癥因子IL-6釋放[24]，但關(guān)于BDE-47誘導(dǎo)機體炎癥反應(yīng)的研究較少。筆者之前用150 mg/kg BDE-47慢性處理ICR小鼠發(fā)現(xiàn)，可促進小鼠肝臟炎癥因子表達，導(dǎo)致肝臟炎癥損傷[19]。本試驗結(jié)果與此一致，證明BDE-47可誘導(dǎo)小鼠肝臟組織炎癥反應(yīng)，但較ICR小鼠，C57BL/6J品系小鼠肝臟對BDE-47的炎癥反應(yīng)更為敏感。此外筆者還發(fā)現(xiàn)，BDE-47可引發(fā)腎臟和腦組織IL-6和TNF-α基因表達增強。相對于肝臟和腦組織，引發(fā)腎臟炎癥反應(yīng)的BDE-47有效劑量較高。

本試驗以C57BL/6J小鼠為對象，評價了慢性BDE-47暴露對肝腎和腦組織臟器系數(shù)的影響，初步揭示了BDE-47對這些組織的毒性作用。BDE-47可能通過引發(fā)氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，毒害肝腎和腦組織，具體的毒作用機制有待進一步深入研究。

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