李倩　蓋江濤　白蓓蓓　葉秀旭　王鵬

摘要：莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（shikimic acid/quinic acid hydroxy cinnamyl transferase，簡稱HCT）是辣椒素苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵的限速酶，其催化的產(chǎn)物對茄科植物具有重要的生理學意義。為了探清HCT在茄科植物基因組中的狀況，重點考察了其在茄科植物基因組中的分布，并利用生物信息學分析的方法，對HCT基因進行全面的鑒定，共獲得擬南芥、煙草、番茄和辣椒的13條基因序列。其次，構(gòu)建了HCT在茄科植物中的系統(tǒng)發(fā)育樹，并對其進行相關(guān)的結(jié)構(gòu)、功能和表達的分析。結(jié)果揭示了茄科植物中HCT基因的親緣關(guān)系;HCT基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)域高度保守，該保守性體現(xiàn)在植物的結(jié)構(gòu)和功能上。本研究為進一步研究茄科植物中的HCT基因的酶學及生理功能提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：茄科植物;莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶;HCT基因;辣椒素;進化;表達

中圖分類號： S641.301文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0065-03

收稿日期：2018-07-03

基金項目：中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務(wù)專項 （編號：1630032018023）。

作者簡介：李 倩（1994—），女，安徽池州人，碩士研究生，研究方向為植物基因組學。E-mail：a827680831@163.com。

通信作者：王 鵬，博士，副研究員，主要從事植物天然產(chǎn)物生物技術(shù)、植物基因組學。E-mail：pwang521@163.com。

辣椒為茄科（Solanaceae）辣椒屬（Capsicum）一年或有限多年生草本植物，是人們常食用的一種風味蔬菜。研究發(fā)現(xiàn)，辣椒的果實中含有豐富的維生素、礦物質(zhì)以及一些微量元素，可以維持人體正常的生理活動，提高身體免疫力，增強人體機能。辣椒素（capsaicin）類物質(zhì)是辣椒中辣味的物質(zhì)基礎(chǔ)，早在1876年，辣椒素就由Thresh分離出來并命名，Nelson最先解析了辣椒素的結(jié)構(gòu)，表明它是一種含香草酰胺的生物堿[1]，主要的物質(zhì)是辣椒堿和二氫辣椒堿[2]。辣椒素的生物合成是個復雜的途徑，其間會涉及到多種酶和代謝物的參與，然而本質(zhì)上，辣椒素主要由苯丙氨酸途徑合成的香草基胺和由支鏈脂肪酸途徑合成的8-甲基-6-癸烯酰經(jīng)辣椒素合成酶（CS）催化縮合而成[3-4]。研究者在辣椒素的合成途徑中，發(fā)掘到了PAL、C4H、HCT、C3H、COMT、KAS、pAMT、ACL和FAT等多個參與辣椒素生物合成的基因[3]，查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，其中莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）是在木質(zhì)素生物合成路徑中發(fā)現(xiàn)較晚的一種酶。

目前普遍認同的木質(zhì)素生物合成途徑大致可以分為3個步驟：（1）莽草酸途徑，由植物光合作用同化產(chǎn)物到芳香氨基酸——苯丙氨酸、絡(luò)氨酸和色氨酸的合成過程;（2）苯丙烷途徑，苯丙氨酸到羥基肉桂酸及其輔酶A酯類;（3）木質(zhì)素合成的特異途徑，羥基肉桂酸輔酶酯類到合成木質(zhì)素單體及其聚合物的過程 [5-7] 。其中研究的重點大都是放在苯丙烷途徑和木質(zhì)素合成特異途徑這2個階段。

HCT是控制木質(zhì)素中的H-單體和G/S-單體相互轉(zhuǎn)化和聚合的關(guān)鍵酶，在苯丙烷3-羥基化步驟上游和下游的苯丙氨酸途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵的雙重調(diào)節(jié)作用[8-9]，其中H-單體主要呈現(xiàn)在禾本科植物中，而S-單體主要在被子植物中存在[6]。Hoffmann等從煙梗提取物中分離純化出一種可以水解羥基肉桂酰基-CoA酯的蛋白質(zhì)，從它的序列分析結(jié)果揭示出該煙草基因?qū)儆谝环N植物酰基轉(zhuǎn)移酶的基因家族，其成員也具有各種功能[10]。最佳的?；w和酰基轉(zhuǎn)移酶是香豆酰輔酶A和咖啡酰輔酶A，該酶能夠催化莽草酸和奎酸酯的合成，也催化其逆反應，從而對苯丙烷途徑中的木質(zhì)素合成有了明確認識。

HCT在茄科植物辣椒的辣椒素生物合成通路中可催化對-香豆酰輔酶A，使其形成C3H底物的同時將C3H的產(chǎn)物咖啡酰莽草酸/奎寧酸進一步催化生成咖啡酰輔酶A。在木質(zhì)素單體的合成通路中，不同的木質(zhì)素單體形成的分水嶺是C3H/HCT，其決定了植物體內(nèi)的碳源流向，是苯丙烷途徑中的限速酶，也是控制木質(zhì)素H-單體與G/S-單體的一個關(guān)鍵點，木質(zhì)素不同單體間的比例差異對它的含量也會有所影響[8]。木質(zhì)素自身具有疏水的化學性質(zhì)，在植物的生長發(fā)育過程中，既可以保持植物細胞內(nèi)的水分，促進植物抵御干旱等不良生態(tài)環(huán)境，還可以提高植物抗病、抗擊外來干擾，維持正常生長的能力。因此推論，對于植物中HCT基因的研究具有重要的生物學意義和功能。目前，已經(jīng)從煙草[10]、擬南芥[11]、番茄[12]、桉樹[13]、歐美楊[14]中克隆出來HCT基因，然而，關(guān)于HCT基因在其他茄科植物中的克隆和鑒定，國內(nèi)鮮有相關(guān)的系統(tǒng)生物信息學研究報道。

本研究以擬南芥、煙草和番茄中的HCT基因序列作為參考，以茄科植物中的辣椒作為研究對象，通過BLAST序列比對的方法獲得這些植物HCT基因家族的全部序列，利用生物信息學分析方法中的系統(tǒng)發(fā)育分析、聚類分析等方法，來預測和分析茄科植物中的HCT基因的相關(guān)性質(zhì)和功能，為后續(xù)HCT基因的研究和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 保守結(jié)構(gòu)域鑒定

把HCT基因的蛋白序列作為query訪問，輸入PfamA數(shù)據(jù)庫開始檢索，獲取相應的結(jié)構(gòu)域信息[15]。

1.2 數(shù)據(jù)庫搜索

搜索擬南芥、煙草、番茄、辣椒的HCT基因組，各基因組數(shù)據(jù)從Phytozome中下載得到[16]。通過搜索該蛋白質(zhì)的模型數(shù)據(jù)庫，再從結(jié)構(gòu)域進行選擇，獲取HCT家族的序列信息。

1.3 序列比對與進化樹構(gòu)建

使用probcons比對之前已經(jīng)搜索到的蛋白質(zhì)序列，再利用Phy ML構(gòu)建與之相對應的系統(tǒng)發(fā)育樹，之后進行1 000次bootstrap分析[17-18]，最后采用Figtree來顯示構(gòu)建的進化樹結(jié)果。

1.4 相對表達量測定

根據(jù)番茄HCT基因的CDs序列設(shè)計引物，提取番茄樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，篩選引物，之后做熒光定量測定相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)域鑒定

通過與Pfam A數(shù)據(jù)庫匹配，從已知擬南芥的HCT基因的蛋白質(zhì)序列中，鑒定得到了1個保守結(jié)構(gòu)域，編號為PF02458.11，顯示該蛋白結(jié)構(gòu)域高度保守，基本占據(jù)了整個蛋白質(zhì)序列的98%，存在很少的非保守序列區(qū)域（圖1）。

2.2 含PF02458.11結(jié)構(gòu)域的基因鑒定

為全面鑒定含有編號為PF02458.11的結(jié)構(gòu)域的基因序列，選取了擬南芥（Arabidopsis thaliana）和茄科植物中煙草（Nicotiana tabacum）、番茄（Solanum lycopersicum）、辣椒（Capsicum annuum）為目標物種，通過BLASTP搜索目標物種基因組的蛋白質(zhì)模型文件，在BLAST結(jié)果中篩選出PF02458.11結(jié)構(gòu)域的序列，最終得到13個HCT家族成員（表1）。

2.3 進化樹構(gòu)建

為闡述植物中HCT家族各成員的進化關(guān)系，通過最大似然法構(gòu)建了HCT家族進化樹，結(jié)果（圖2）顯示，此家族可分為2條明顯的獨立分支（分別命名為Ⅰ和Ⅱ），共有13條氨基酸序列，其中擬南芥1條、番茄2條、煙草4條、辣椒6條。煙草的2個HCT基因、番茄的1個HCT基因、辣椒的2個HCT基因聚為一支，說明這些基因的親緣關(guān)系較近;煙草的2個HCT基因、番茄的1個HCT基因、辣椒的4個HCT基因、擬南芥的1個HCT基因聚為另一支，其中擬南芥單獨分支，說明擬南芥與這些基因的親緣關(guān)系較遠（圖3）。

2.4 HCT基因相對表達量分析

通過建立熱圖來進行茄科植物中番茄的HCT基因相對表達量的差異分析。測定結(jié)果（圖4）表明，共有野生型和突變型2個基因型，包含3個發(fā)育時期：幼果期、轉(zhuǎn)色期和成熟期，整體來看它們在基因中的表達量較符合生長發(fā)育的規(guī)律。其中野生型內(nèi)的Solyc07g043670.1.1、Solyc12g006330.1.1、Solyc09g014280.1.1基因和突變型內(nèi)的Solyc09g092270.2.1基因在幼果期表達量低，在成熟期表達量高。

3 討論與結(jié)論

木質(zhì)素的生物合成是植物體內(nèi)碳素次級代謝的一個環(huán)節(jié)，HCT是木質(zhì)素合成途徑中研究較晚的一種酶，同時在辣椒素苯丙氨酸合成通路的苯丙烷C3羥基化的代謝途徑中充當關(guān)鍵酶和限速酶的重要角色，其代謝產(chǎn)物在植物生長發(fā)育的生命活動過程中肩負著不可或缺的作用，這些物質(zhì)的相對含量也總是與HCT基因的活性保持著關(guān)聯(lián)性，因而HCT基因?qū)τ谥参锏纳{(diào)控具有重大的生物學意義。

本研究對擬南芥、煙草、番茄和辣椒這4種植物的13條HCT基因家族蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示了茄科植物之間HCT基因的親緣進化關(guān)系，還鑒定到另一個分支的7條序列與擬南芥的HCT基因分別在2個分支，親緣關(guān)系較遠，推測這些基因可能會在茄科植物中發(fā)揮重要的生理功能，同時隨著研究的深入，不斷增加的HCT基因完整序列將會構(gòu)建出更加豐富的系統(tǒng)發(fā)育樹。相對表達量的測定結(jié)果顯示，本試驗設(shè)定的參考對象番茄符合植物生長發(fā)育的規(guī)律，在幼果期表達量低，成熟期表達量高。

目前，人們對于苯丙烷代謝途徑中的基因研究較多，雖有一些關(guān)于植物中HCT基因的研究，但鮮有研究從茄科植物的HCT基因家族層面來分析它的系統(tǒng)進化，包括在辣椒素的相關(guān)合成通路中的生長調(diào)控影響，還有該基因的表達與辣椒辣味之間的聯(lián)系，以及比較茄科植物中HCT基因的性質(zhì)和功能等等一系列的問題亟待解決。因此本研究以茄科植物為研究對象，對它們的序列結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、進化進行系統(tǒng)分析，為后續(xù)研究茄科植物中的HCT基因提供參考依據(jù)和理論基礎(chǔ)，促進茄科植物在育種工作中的進一步發(fā)展。

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