鄒淑慧，李金亮，廖莎莎，張麗琴，劉聰

（贛州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 贛州 341000）

至2015年5月以來(lái)，寨卡病毒 （Zika Virus，ZIKV）在美洲區(qū)域的傳播不斷升級(jí)，疫情逐步惡化，甚至有城市化和全球化傳播趨勢(shì)，對(duì)國(guó)際公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅[1]。2016年2月，我國(guó)出現(xiàn)首例輸入性寨卡病毒感染，隨后國(guó)內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)多例ZIKV感染病例，引起我國(guó)政府和衛(wèi)生部門的廣泛關(guān)注[2]。

寨卡病毒屬黃病毒屬，為單股正鏈RNA，長(zhǎng)約11kb，分為亞洲型和非洲型[3]，在系統(tǒng)發(fā)生樹上與同為黃病毒屬的登革熱病毒、Spondweni病毒、日本腦炎病毒、西尼羅病毒非常相近[4]。寨卡病毒基因編碼多聚蛋白，包括病毒衣殼蛋白C，膜前體蛋白PrM，包膜蛋白 E和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。 E 蛋白是病毒表面的主要蛋白，參與調(diào)節(jié)結(jié)合以及膜融合等方面。非結(jié)構(gòu)蛋白中的NS5是病毒中最大的蛋白，含有RNA-依賴RNA聚合酶和甲基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)病毒基因組RNA的合成及加帽[5,6]。本研究將從生物信息的角度分析ZIKV E蛋白和 NS5蛋白序列特征，為進(jìn)一步挖掘其基因信息，研究其致病機(jī)制提供分子依據(jù)，從而預(yù)防和控制寨卡病毒的感染與流行。

1 材料和方法

1.1 序列來(lái)源 所有病毒株E和NS5核苷酸、氨基酸序列均來(lái)源于GenBank中已登記的黃病毒屬相關(guān)參考序列。

1.2 ZIKV E、NS5核苷酸與氨基酸同源性比較 用Clustal X和Bioedit軟件對(duì)ZIKV不同地理株系及同屬成員的E、NS5基因及編碼蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算核苷酸與氨基酸同源性。

1.3 ZIKV E、NS5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 選取中國(guó)首例分離的ZIKV基因組序列（登陸號(hào)：KU744693.1）為研究對(duì)象[2]，獲取E、NS5基因及氨基酸序列。通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站Predict Protein Server（https：//www.predictprotein.org/）分析 E、NS5 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)E、NS5蛋白的氨基酸組成以及蛋白序列可能存在的蛋白結(jié)合區(qū)、α螺旋區(qū)、β折疊區(qū)以及卷曲結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行分析，同時(shí)預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)中可能的暴露區(qū)域和隱藏區(qū)域。

1.4 ZIKV E、NS5蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)分析 利用在線 軟 件 TMHMM v2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)E、NS5蛋白氨基酸序列進(jìn)行跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，從而分析跨膜段、膜內(nèi)段和膜外段的氨基酸序列。

1.5 ZIKV E、NS5蛋白的信號(hào)肽分析 應(yīng)用Anthe-Pro軟件分析E、NS5蛋白氨基酸序列中可能存在的潛在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。

1.6 ZIKV E、NS5蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè) 運(yùn)用 Bepipred（http：//tools.iedb.org/bcell/）在線服務(wù)器程序預(yù)測(cè)E、NS5蛋白中可能的B細(xì)胞線性表位，得分大于0.350（軟件默認(rèn)值）則預(yù)測(cè)為優(yōu)勢(shì)線性B表位。

2 結(jié)果

2.1 ZIKV E、NS5核苷酸與氨基酸同源性分析 通過(guò)比較ZIKV不同地理株系及同屬成員的E、NS5蛋白核苷酸和氨基酸的同源性，結(jié)果顯示不同地理株的ZIKV E蛋白核苷酸和氨基酸同源性分別為87.1%～100%和94.2%～100%，跟同黃病毒屬其他成員比較，發(fā)現(xiàn)與Spondweni病毒更接近，氨基酸同源性最高達(dá)72.8%（表1）。不同地理株的ZIKV NS5蛋白核苷酸和氨基酸同源性分別為88%～99.9%和95.5%～100%，跟同黃病毒屬其他成員比較，也是與Spondweni病毒更接近，氨基酸同源性最高達(dá)77.5%（表2）。

2.2 ZIKV E、NS5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu) E蛋白編碼504個(gè)氨基酸，可能的蛋白結(jié)合位點(diǎn)有14個(gè)，主要位于 1～13、55～161、232～394aa 區(qū)段；α 螺旋區(qū)主要集中在 406～418、436～501aa區(qū)段，占 15.28%；β 折疊片主要在 2～73、91～143、165～216、236～401aa 區(qū)段，占33.93%；無(wú)規(guī)則卷曲占50.79%；此外，在蛋白中還可能包含兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域 （461～479aa、483～501aa）。整個(gè)蛋白暴露區(qū)域和隱藏區(qū)域均勻相間分布，見(jiàn)圖1。NS5蛋白編碼903個(gè)氨基酸，可能的蛋白結(jié)合位點(diǎn)有22個(gè)，主要位于6～119、247～418、518～744、895～899aa 區(qū)段；多聚核苷酸結(jié)合位點(diǎn)有兩個(gè)，位于741aa和856aa；α螺旋區(qū)主要集中在 2 ～67、158 ～288、350 ～444、545 ～575、611 ～627、753～888aa區(qū)段，占36.88%；β折疊片主要在74～146、578～606、702～743aa 區(qū)段，占 11.52%；無(wú)規(guī)則卷曲占51.60%；整個(gè)蛋白暴露區(qū)域和隱藏區(qū)域均勻相間分布，見(jiàn)圖1。

2.3 ZIKV E、NS5蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu) TMHMM預(yù)測(cè)E蛋白有兩個(gè)跨膜區(qū)域，分別為455～477aa、484～503aa，膜外區(qū)域?yàn)?1～454aa，膜內(nèi)區(qū)域?yàn)?478～483aa，見(jiàn)圖2。整個(gè)NS5蛋白均位于膜外，無(wú)跨膜區(qū)域，見(jiàn)圖3。

2.4 ZIKV E、NS5蛋白的信號(hào)肽 E和NS5蛋白均存在潛在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，其信號(hào)肽斷裂位點(diǎn)分別位于 501aa 和 152aa，見(jiàn)圖 4、圖 5。

2.3 ZIKV E、NS5蛋白的B細(xì)胞抗原表位 運(yùn)用Bepipred法預(yù)測(cè)B細(xì)胞線性表位，結(jié)果顯示E蛋白平均抗原性指數(shù)為0.062，分子內(nèi)有多個(gè)可能的抗原表位區(qū)域。其中分值最高的表位區(qū)域?yàn)?17～342aa，分值達(dá)1.919（閾值0.350）；其次為155～181、66～89、226～238、380～384aa （按分值高低排列），見(jiàn)圖6。NS5蛋白平均抗原性指數(shù)為0.107，分值最高表位區(qū)域?yàn)?00～114aa，分值達(dá)2.297；其次為 360～372、148～159、688～707aa，見(jiàn)圖 7。

表1 E蛋白核苷酸和氨基酸的同源性比較

表2 NS5蛋白核苷酸和氨基酸的同源性比較

圖1 E蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（1A）及組成成分（1B）、NS5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（1C）及組成成分（1D）

圖2 E蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)

圖3 NS5蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)

圖4 E蛋白信號(hào)肽結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 NS5蛋白信號(hào)肽結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論

ZIKV屬于黃病毒科黃病毒屬的一種蟲媒病毒，且是一種人獸共患病毒。寨卡病毒可引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損害，包括格林巴利綜合征（GBS）及新生兒小頭畸形，已經(jīng)成為威脅全球人類健康的潛在因素[7]。目前尚無(wú)針對(duì)性的預(yù)防性疫苗和治療性藥物，因此開(kāi)發(fā)相關(guān)疫苗迫在眉睫。

圖6 Bepipred工具預(yù)測(cè)E蛋白的線性B細(xì)胞表位

圖7 Bepipred工具預(yù)測(cè)NS5蛋白的線性B細(xì)胞表位

在基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)代，基于疫苗開(kāi)發(fā)、單克隆抗體的制備以及快速檢測(cè)試劑盒的研制，運(yùn)用生物信息學(xué)工具分析蛋白質(zhì)序列已成為蛋白質(zhì)研究的重要手段[8]。本文通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)不同地理株系的ZIKV E蛋白和NS5蛋白同源性都比較高，提示這兩段序列比較保守。跟同黃病毒屬其他成員比較，顯示與Spondweni病毒關(guān)系最近，但同源性也僅有70%多。說(shuō)明ZIKV雖然與其他黃病毒發(fā)病癥狀相似，但可能已經(jīng)發(fā)展出不同的致病機(jī)制。

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)抗原表位影響很大，α螺旋、β折疊的化學(xué)鍵鍵能較高，成為蛋白質(zhì)中心的“支架”，很難與合適的抗體嵌合，而β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲常位于分子表面，利于抗體結(jié)合，成為抗原表位的可能。本研究通過(guò)Predict Protein Server分析發(fā)現(xiàn)ZIKV E蛋白和NS5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲含量最高，分別占50.79%和51.60%，推斷這些區(qū)域與B細(xì)胞表位有關(guān)。另外E蛋白和NS5蛋白中還包含有多個(gè)可能的蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)，提示可能參與多種蛋白或者其他分子之間的相互作用并在ZIKV感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可對(duì)這些相關(guān)功能位點(diǎn)進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步揭示ZIKV的浸染機(jī)制。外膜蛋白通過(guò)加強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的攝取，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞活化，在免疫反應(yīng)中表現(xiàn)出重要作用，常作為保護(hù)性疫苗候選抗原?？缒^(qū)域預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示E蛋白有兩個(gè)跨膜區(qū)域，其中氨基酸1～454位于膜外，而NS5均位于膜外。研究表明抗原表位可能不在這兩個(gè)跨膜域中[9]。在跨膜蛋白的N端，有一段疏水性氨基酸序列，稱為信號(hào)肽，新合成的蛋白質(zhì)通過(guò)該信號(hào)肽進(jìn)入正常的分選途徑。軟件分析表明E蛋白和NS5蛋白含有信號(hào)肽，為分泌性蛋白。

抗原優(yōu)勢(shì)表位的確定是疫苗研制和臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的抗原優(yōu)勢(shì)表位，并通過(guò)體外合成肽段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)抗原表位的鑒定[10]。Bepipred方法是結(jié)合線性B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)的一種經(jīng)典算法。本研究通過(guò)該方法預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，ZIKV E蛋白平均抗原性指數(shù)為0.062，分子內(nèi)有多個(gè)可能的抗原表位區(qū)域， 如：317～342aa、155～181、66～89、226～238、380～384aa。NS5蛋白平均抗原性指數(shù)為0.107，可能的表位區(qū)域有 100～114aa，、360～372、148～159、688～707aa。對(duì)于進(jìn)一步確認(rèn)E、NS5蛋白的優(yōu)勢(shì)表位信息，需要通過(guò)體外試驗(yàn)、動(dòng)物模型等來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究預(yù)測(cè)的相關(guān)線性表位將為進(jìn)一步E、NS5蛋白抗原表位的確證及診療抗體的開(kāi)發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

總之，本研究對(duì)ZIKV E蛋白和NS5蛋白的生物信息學(xué)分析，成功預(yù)測(cè)到其基本的結(jié)構(gòu)特征和潛在的線性B細(xì)胞表位。這將有助于對(duì)E、NS5蛋白的深入研究奠定理論基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)ZIKV快速檢測(cè)的膠體金試劑盒和治療性抗體提供研究基礎(chǔ)。