凌 歡 周云峰

乳腺癌是目前女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率逐年升高，根據(jù)最新的國(guó)家癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年新發(fā)患者近28萬(wàn)，是中國(guó)女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤［1，2］。DNA損傷應(yīng)答特定基因的遺傳性或獲得性突變使乳腺癌細(xì)胞對(duì)特定的DNA損傷應(yīng)答抑制劑敏感，例如乳腺癌易感基因1/2（Breast cancer susceptibility genes 1/2，BRCA1/2）突變的細(xì)胞對(duì)poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）抑制劑敏感［3］。共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因Rad3相關(guān)激酶（Ataxia telangiectasia mutated，and Rad3 related kinase，ATR）是損傷應(yīng)答的重要元件，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)DNA復(fù)制壓力或DNA損傷時(shí)，ATR與其配體ATRIP結(jié)合被招募到RPA-單鏈 DNA（single-stranded DNA，ssDNA）上形成ATR-ATRIP復(fù)合物，并發(fā)生自磷酸化；隨后 RHINO、Rad17、9-1-1復(fù)合物以及 TopBP1，被募集到dsDNA-ssDNA接合處結(jié)合ATR自磷酸化位點(diǎn)而激活A(yù)TR-ATRIP。隨后激活chk1、FANCI、WRN等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程、穩(wěn)定復(fù)制叉并促進(jìn)DNA的損傷修復(fù)［4］。腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞更依賴(lài)ATR分子調(diào)控基因組的損傷修復(fù)而促進(jìn)細(xì)胞存活，它對(duì)ATR抑制劑的抑制作用更敏感［5］。因此，ATR抑制劑可能為乳腺癌中繼PARP抑制劑的另一抑制修復(fù)的理想藥物。

VE-822是ATR抑制劑VE-821的高選擇性和有效的衍生物，體內(nèi)外研究表明，它可通過(guò)抑制Chk1 Ser345的磷酸化而引起細(xì)胞周期阻滯和DNA損傷增加［6］。還有研究表明，VE-822通過(guò)干擾復(fù)制叉的起始和阻礙其延伸而增強(qiáng)三陰性乳腺癌對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶I的敏感性，且增強(qiáng)三陰性乳腺癌的放療敏感性［7，8］。此外，它還可增強(qiáng)急性髓系白血病對(duì)靶向核糖核酸酶的核苷類(lèi)似物的敏感性，在體內(nèi)外可提高食管鱗癌和腸癌的化療敏感性，以及增強(qiáng)胰腺癌放療敏感性［7～10］。但目前尚無(wú)報(bào)道包括 VE-822在內(nèi)的ATR抑制劑是否能夠有效殺傷雌激素受體陽(yáng)性（Estrogen receptor positiv，ER+）的乳腺癌，此類(lèi)乳腺癌患者約占3/4，且有研究報(bào)道ER+的乳腺癌中，ERα信號(hào)通路嚴(yán)重干擾了DNA正常的損傷應(yīng)答［11］。為此，本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的VE-822處理的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；VE-822（S8161）購(gòu)于上海藍(lán)木化工有限公司；CCK8試劑盒、細(xì)胞周期（碘化丙啶，Propidium PI法）及細(xì)胞凋亡（FITC-Annexin V/PI法）流式檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于蘇州 us everbright公司；p-ATR、p-chk1、γ-H2AX抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司，BRCA1抗體購(gòu)于Proteintech公司，rad51抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2孵箱濕潤(rùn)培養(yǎng)。選處于對(duì)數(shù)培養(yǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞增殖檢測(cè) 處于對(duì)數(shù)培養(yǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化后，接種于96孔板，每孔2000～5000個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)于100μl DMEM培養(yǎng)基中，貼壁12 h后給予0.5 μM、1μM、2μM、4μM、8μM的VE-822，其中DMSO處理組為對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。24 h、48 h、72 h后每孔加入10μl CCK8試劑，培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度（A）值。細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組A值-培養(yǎng)基A值）/（對(duì)照組A值-培養(yǎng)基A值）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞鋪板，貼壁12 h后給予0.5μM VE-822，DMSO處理組為對(duì)照組，收集加藥后培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)一步操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。給與0.5μM、2μM VE822，DMSO處理組為對(duì)照組，收集加藥后培養(yǎng)72 h的細(xì)胞，按細(xì)胞凋亡試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟操作后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集不同濃度VE-822處理72h的MCF-7細(xì)胞，磷酸鹽緩沖（PBS）溶液洗3次，加入RIPA細(xì)胞裂解液后超聲破碎，離心后取上清，按4∶1比例加入5×蛋白緩沖液SDS，細(xì)胞蛋白樣品于100℃水浴5 min。采用BCA法將各組細(xì)胞樣品的蛋白濃度調(diào)整一致后，各取10μl蛋白樣品進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺SDSPAGE凝膠凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，含5%的脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，分別加待檢測(cè)蛋白的一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST溶液洗5次，10 min/次，相應(yīng)二抗（1∶2000）室溫孵育2 h，TBST溶液洗5次，10 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VE-822對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響 VE-822實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的MCF-7細(xì)胞增殖率明顯受到抑制（P＜0.05），且隨著VE-822濃度及作用時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖抑制的效率升高（P＜0.05）。VE-822作用于MCF-7細(xì)胞的24 h的IC50值為5.982 μM，48 h的 IC50值為1.451μM，72 h的 IC50值為0.559μM（圖1）。

圖1 不同濃度VE-822對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖率的影響

2.2VE-822誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞凋亡分析實(shí)驗(yàn)組中經(jīng)VE-822干預(yù)72 h的MCF-7細(xì)胞與對(duì)照組相比，凋亡明顯增多（P＜0.05），特別是0.5 μM、2μM VE-822處理組的MCF-7細(xì)胞早期凋亡率較對(duì)照組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（封四圖2）。

2.3VE-822對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響 流式檢測(cè)分析0.5μM VE-822干預(yù)24 h的MCF-7細(xì)胞，較DMSO對(duì)照組，VE-822干預(yù)的細(xì)胞明顯被阻滯在G1期，G1期的細(xì)胞比例增加，S和G2/M期的細(xì)胞比例減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（封四圖3）。

2.4VE-822對(duì)MCF-7細(xì)胞的作用機(jī)制 Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的 p-ATR、p-chk1、BRCA1、rad51、γ-H2AX的蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)組中p-ATR、p-chk1、BRCA1、rad51蛋白含量較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組中 γ-H2AX蛋白含量與對(duì)照組相比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖4）

3 討論

目前，乳腺癌的發(fā)病率位居中國(guó)女性惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重危害女性的健康［12］。其中，激素受體（hormone receptor，HR）陽(yáng)性的乳腺癌約占75%，雖然內(nèi)分泌治療對(duì)此類(lèi)乳腺癌患者提供了重要幫助，但仍有部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移［13］。因此，進(jìn)一步探索此類(lèi)乳腺癌的生物學(xué)行為，尋找調(diào)控機(jī)制及主要靶點(diǎn)，并對(duì)其干預(yù)，可為提高生存率提供幫助。損傷修復(fù)基因的缺陷不僅與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，異常的修復(fù)更是引起傳統(tǒng)治療抵抗的主要原因之一。ER+的乳腺癌中，受ER信號(hào)通路的影響，存在異常的DNA損傷修復(fù)［11］。

ATR是損傷修復(fù)的重要感應(yīng)元件，當(dāng)基因組受到損傷時(shí)，ATR被激活，募集下游修復(fù)因子至損傷部位，從而引起細(xì)胞周期阻滯、穩(wěn)定復(fù)制叉、促進(jìn)DNA的損傷修復(fù)［14］。體內(nèi)外研究表明，高選擇性ATR抑制劑VE-822可有效增加包括三陰性乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤 DNA損傷的持久性［7～10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，VE-822可降低MCF-7細(xì)胞的增值率，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)效應(yīng)。流式凋亡分析及凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)證實(shí)此藥物可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡增加。流式細(xì)胞周期檢測(cè)分析提示，VE-822引起MCF-7細(xì)胞G1/S期阻滯，與Fokas等的研究結(jié)果即VE-822（80 nM）單獨(dú)增加MiaPaCa-2和PSN-1細(xì)胞停留在G1期的比率一致。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，VE-822處理的 MCF-7細(xì)胞的 p-ATR、p-chk1、BRCA1、rad51的表達(dá)均下降，γ-H2AX的表達(dá)增加。BRCA1不僅是ATR-chk1下游通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子，并且調(diào)節(jié)堿基切除修復(fù)因子如8-oxoG DNA glycosylase 1（OGG1），endonuclease III-like homolog 1（NTH1）和 APE1轉(zhuǎn)錄［15］，而γ-H2AX作為DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志，與非同源重組修復(fù)密切相關(guān)。H2AX除了在雙鏈斷裂的識(shí)別和修復(fù)中發(fā)揮作用外，還參與DNA復(fù)制的監(jiān)控。組蛋白H2AX還能以ATR依賴(lài)的方式磷酸化，以應(yīng)對(duì)復(fù)制應(yīng)激［16］。因此推測(cè)VE-822可能通過(guò)抑制ATRChk1損傷應(yīng)答通路，繼而通過(guò)抑制BRCA1，不僅抑制同源重組修復(fù)（homologous recombination，HR），而且可能通過(guò)γ-H2AX抑制了非同源重組修復(fù)通路（nonhomologous end joining，NHEJ）。因此，VE-822可有效抑制MCF-7細(xì)胞修復(fù)，使損傷持久，繼而誘導(dǎo)凋亡。

綜上所述，ATR抑制劑VE-822可有效抑制MCF-7細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其G1/S細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能通過(guò)抑制MCF-7細(xì)胞的HR和NHEJ相關(guān)通路，使損傷不能被修復(fù)相關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究探討。VE-822有望成為治療HR+、HER2-乳腺癌的有效藥物，其臨床應(yīng)用效果和價(jià)值需要進(jìn)一步驗(yàn)證。