黃志昂 尚 艷 劉方方 賽亞飛 路武杰 馮志軍

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種以氣流受限為主要特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其病情常呈進(jìn)行性進(jìn)展，患病率及病死率較高，嚴(yán)重危害患者身體健康，已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。COPD主要累及肺臟，病因較為復(fù)雜，炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是其主要發(fā)病機(jī)制，但目前尚未找到有效治療方案［2］。干細(xì)胞是一類能特異性分化成各種組織器官的細(xì)胞，目前臨床上以被應(yīng)用于多種疾病的治療中，其中脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（amniotic-derivedmesenchymalstem cells，ADMSCs）因具有強(qiáng)大自我更新能力及分化潛能，業(yè)已成為再生醫(yī)學(xué)及組織工程學(xué)應(yīng)用較多的理想種子細(xì)胞［3］。研究證明，干細(xì)胞移植對(duì)多種肺損傷均有較好的修復(fù)作用［4，5］，但 ADMSCs治療肺疾病方面的研究較少。本研究采用熏香煙加氣管注入內(nèi)毒素誘導(dǎo)的COPD大鼠模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將培養(yǎng)ADMSCs移植到模型鼠肺臟組織內(nèi)，觀察外源性的ADMSCs對(duì)模型鼠肺臟組織的病理和生化指標(biāo)的影響，藉以探究 ADMSCs在COPD治療中的價(jià)值，為臨床治療COPD另辟思路。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1COPD模型的制備與分組 取健康SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重（220±20）g（由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供），將其隨機(jī)分對(duì)照組、治療組及模型組，治療組和模型組大鼠進(jìn)行COPD模型的制備，對(duì)照組不進(jìn)行造模。取40只SPF大鼠，給予生理鹽水 10 ml/（kg·d）灌胃 4周后開(kāi)始建模，于建模第 1、14 d經(jīng)氣管注入2 g/2l內(nèi)毒素（Sigma）200μl，第2～30 d（第14 d除外）將大鼠置入有機(jī)玻璃倉(cāng)內(nèi)，注入過(guò)濾嘴香煙煙霧，0.5 h/d，每天以生理鹽水灌胃，以大鼠出現(xiàn)頻繁咳嗽癥狀作為判斷造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2ADMSCs的分離、培養(yǎng) 另取健康SPF級(jí)雄性SD大鼠2只，頸椎脫臼法處死，分離附睪及腹股溝處脂肪組織，PBS沖洗后剪碎，取少量置于離心管內(nèi)，加入膠原酶混勻，于37℃消化2 h，加入低糖DMEM培養(yǎng)基，混勻后離心10 min，棄上清液，PBS沖洗2遍，加入完全培養(yǎng)基，混勻后吸取少量懸浮液接種于培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)；體積分?jǐn)?shù)5%時(shí)轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，加入胰酶消化，按1∶2比例傳代培養(yǎng)；于第3代細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)加入含溴氮胞苷（BrdU），37℃孵育30 min，PBS沖洗，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞標(biāo)記情況，消化細(xì)胞傳代培養(yǎng)。使用免疫組化技術(shù)、細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物鑒定體外培養(yǎng)的ADMSCs及誘導(dǎo)分化的細(xì)胞。

1.3ADMSCs的移植 造模成功后1周，對(duì)照組及模型組大鼠經(jīng)尾靜脈注射0.5 ml生理鹽水，治療組大鼠尾靜脈注射0.5 ml BrdU標(biāo)記的ADMSCs懸液。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1 肺功能 用小動(dòng)物肺功能測(cè)定儀測(cè)定各組大鼠1 s時(shí)間用力呼出量（FEV1）及其與用力肺活量之比（FEV1/FVC）、最大呼氣中期流速（MMEF）、最大呼氣流量（PEF）等。

1.4.2炎癥因子水平測(cè)定 細(xì)胞移植后14 d時(shí)，打開(kāi)大鼠胸腔，使氣管及雙肺暴露，切開(kāi)氣管，血管鉗夾閉右側(cè)主支氣管支，左肺注入生理鹽水進(jìn)行灌洗，停留數(shù)秒后抽出灌洗液，離心棄去上清液備用。吸取灌洗液滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，低倍鏡視野下計(jì)數(shù)；另取少量細(xì)胞涂片及瑞氏染色，選取細(xì)胞計(jì)數(shù)板上的白細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)分類計(jì)數(shù)，計(jì)算各種白細(xì)胞百分率。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定灌洗液中白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、及C反應(yīng)蛋白（CRP）水平。試劑盒由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.3病理變化 取大鼠右肺，多聚甲醛固定、石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。每例選擇3張切片，隨機(jī)選取5個(gè)視野，避開(kāi)支氣管及大、中型血管，觀測(cè)下列指標(biāo)：

1）肺泡間隔數(shù)（MLI）：以每個(gè)視野正中為中心作“+”字交叉線，計(jì)數(shù)經(jīng)此“+”字線的肺泡間隔數(shù)，測(cè)定+字線長(zhǎng)度；肺平均內(nèi)襯間隔（MLI）=肺泡間隔數(shù)/“+”字線長(zhǎng)度。

2）單位面積肺泡數(shù)（MAN）：視野里的肺泡數(shù)除以視野的面積。

3）平均肺泡面積（MAA）：MAA=（每個(gè)視野的面積-HE染色陽(yáng)性區(qū)域面積）/肺泡數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ADMSCs培養(yǎng)結(jié)果 ADMSCs原代培養(yǎng)后可見(jiàn)貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)6 d后細(xì)胞呈梭形；3代培養(yǎng)后形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞見(jiàn)可見(jiàn)脂滴存在（見(jiàn)封三圖1）。

2.2各組肺功能指標(biāo)的比較 與對(duì)照組比較，模型組和治療組肺功能指標(biāo)均顯著下降（P＜0.05），而治療組肺功能優(yōu)于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3各組白細(xì)胞及免疫相關(guān)指標(biāo)的比較 模型組和治療組肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)及IL-8、TNF-α、CRP水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），治療組各免疫細(xì)胞數(shù)及免疫相關(guān)指標(biāo)水平均顯著低于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表2、3。

2.4各組肺組織病理變化 模型組、治療組肺組織切片均可見(jiàn)COPD病理性變化，治療組較模型組肺氣腫病理改變輕（見(jiàn)封三圖2）。各組肺組織MLI、MAN、MAA比較差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表1 各組肺功能指標(biāo)的比較x±s

表1 各組肺功能指標(biāo)的比較x±s

與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 n FEV1（L） FEV1/FVC（%） MMEF（L/s） PEF（L/s ）對(duì)照組20 2.18±0.22 82.89±3.25 1.88±0.21 4.92±0.13模型組 20 0.98±0.15* 40.66±4.26* 0.89±0.22* 3.98±0.21*治療組 20 1.67±0.25*# 69.09±2.99*# 1.42±0.19*# 4.44±0.11*#

表2 各組白細(xì)胞及其相關(guān)分類的比較±s

表2 各組白細(xì)胞及其相關(guān)分類的比較±s

組別 n 白細(xì)胞（×109/L） 巨噬細(xì)胞（%） 中性粒細(xì)胞（%）對(duì)照組20 2.36±0.47 1.58±0.29 6.99±1.26模型組 20 6.27±1.01* 3.26±0.45* 26.79±1.69*治療組 20 3.98±0.28*# 2.27±0.29*# 14.37±1.35*#

表3 各組免疫相關(guān)指標(biāo)的比較±s

表3 各組免疫相關(guān)指標(biāo)的比較±s

與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 n IL-8（ng/L） TNF-α（g/L） CRP（ng/L）對(duì)照組20 24.37±2.49 20.38±3.56 2.38±0.39模型組 20 55.89±3.27* 69.39±4.22* 20.31±4.28*治療組 20 33.38±2.33*# 34.70±3.61*# 8.92±1.33*#

表4 各組肺組織病理指標(biāo)的比較±s

表4 各組肺組織病理指標(biāo)的比較±s

與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 n MLI（μm） MAN（106/m2） MAA（μm2）對(duì)照組20 58.38±8.22 398.45±20.48 4980.33±389.48模型組 20 88.39±9.01* 201.33±23.82* 8189.24±478.56*治療組 20 66.07±3.57*# 325.39±24.28*# 5827.33±390.45*#

3 討論

研究認(rèn)為，COPD的發(fā)病機(jī)制主要以炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)為主要特征，炎癥細(xì)胞的聚集、活性氧及蛋白水解酶類釋放，以及蛋白酶的水解和氧化損傷的發(fā)生，導(dǎo)致不可逆的上皮細(xì)胞凋亡及小氣道壁受損、肺泡腔擴(kuò)大，最終導(dǎo)致COPD的發(fā)生。目前COPD主要以消除炎癥、擴(kuò)張支氣管等緩解癥狀的治療，尚無(wú)有效逆轉(zhuǎn)肺損傷的治療方式。因此，尋找修復(fù)肺部組織結(jié)構(gòu)的有效方法是從根本上治療COPD的關(guān)鍵措施。

間充質(zhì)干細(xì)胞是具有一定更新能力及多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在適宜情況下可向多種中胚層及神經(jīng)外胚層來(lái)源的組織細(xì)胞分化。目前臨床上骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用較廣。近年來(lái)研究表明，脂肪組織中同樣具有大量間充質(zhì)干細(xì)胞，具有體外增值及多重分化的潛能，可用于組織和器官的再生與修復(fù)。相較于其他間充質(zhì)干細(xì)胞，ADMSCs的取材較為簡(jiǎn)單，脂肪中的間充質(zhì)干細(xì)胞含量豐富，且ADMSCs免疫源性較低，可減少移植的排斥反應(yīng)，臨床引用價(jià)值較大。研究認(rèn)為，脊髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)、外可分化為肺上皮細(xì)胞，促進(jìn)肺組織的再生。另外，其還可分泌細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子等多種生物活性物質(zhì)，抑制肺組織的凋亡，改善組織損傷部位及微環(huán)境，為損傷的修復(fù)提供有利的環(huán)境，有利于COPD的治療，但ADMSCs在COPD臨床治療研究報(bào)道尚少。

本研究采用熏香煙加氣管注入內(nèi)毒素方法誘導(dǎo)大鼠建立COPD模型后，比較對(duì)照組與模型組大鼠肺功能、炎癥因子及病理切片情況，顯示模型組肺功能顯著低于對(duì)照組，其炎癥因子水平均顯著升高，病理切片示顯著的肺水腫征象，提示本研究COPD建模情況較好，建模大鼠均出現(xiàn)COPD相關(guān)癥狀及病理診斷征象，也進(jìn)一步提示炎癥反應(yīng)是COPD發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。

為探究ADMSCs對(duì)COPD肺損傷的作用，比較采用ADMSCs移植治療的大鼠和未行ADMSCs移植治療大鼠的肺部功能及相關(guān)炎癥指標(biāo)，結(jié)果顯示，治療組肺功能顯著優(yōu)于模型組，且相關(guān)炎癥因子水平均顯著低于建模組，證實(shí) ADMSCs可一定程度上改善COPD大鼠的肺功能，并降低炎癥因子的表達(dá)。

研究表明，TNF-α可直接損傷毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，聚集、黏附及激活中心粒細(xì)胞，使中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量的氧自由基，加速肺臟損傷，而IL-8等炎癥因子均可對(duì)TNF-α起到重要的協(xié)同作用。本研究顯示ADMSCs可明顯降低相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而緩解COPD的相關(guān)癥狀。對(duì)各組肺部病理切片分析發(fā)現(xiàn)，治療組較模型組肺氣腫病理改變輕，提示ADMSCs可促進(jìn)肺損傷的修復(fù)。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞保護(hù)和修復(fù)作用的生長(zhǎng)因子，可刺激血管生成、抑制纖維化及細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示，ADMSCs可能具有類似的作用，起到減輕肺組織細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肺受損部位修復(fù)的功效。吳林等［6］探究小鼠ADMSCs對(duì)減緩百草枯重度引起的肺損傷的作用效果，顯示ADMSCs治療組小鼠血漿中的TNF-α、IL-1β的含量顯著低于未治療組，且肺組織病理染色示ADMSCs治療組肺組織纖維化程度顯著低于未治療組；常鵬宇等［7］也證實(shí)人脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞可抑制放射性肺纖維化進(jìn)展，對(duì)肺組織有一定的保護(hù)作用。本研究進(jìn)一步證實(shí)ADMSCs對(duì)COPD大鼠肺損傷也有一定的治療作用。

綜上，ADMSCs移植治療可顯著改善COPD大鼠肺組織的病理性改變，減輕炎癥反應(yīng)，改善肺功能，具有一定的治療作用。