閆方艷 李錦平 武莉 馮吉波

摘要：目的 ?基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討燈盞花素和胰島素抵抗相關(guān)靶點之間的相互作用及其作用機制。方法 ?通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）結(jié)合文獻挖掘確定燈盞花素的主要活性成分，多個數(shù)據(jù)庫聯(lián)用檢索和篩選活性成分對應(yīng)靶點，構(gòu)建活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，并通過SystemsDock web site對其進行對接驗證，利用DAVID數(shù)據(jù)庫對靶點生物功能及相關(guān)通路進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果 ?經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索及文獻查證，燈盞花素主要活性成分為燈盞乙素，網(wǎng)絡(luò)拓撲分析篩選出與胰島素抵抗治療密切相關(guān)的潛在關(guān)鍵靶點4個（NOS3、PTPN1、ADORA1、PRKCG），參與代謝調(diào)控、炎癥反應(yīng)和有機氮化合物代謝等生物過程，通過干預(yù)PI3K-Akt、Ras、Insulin resistance和HIF-1等相關(guān)通路發(fā)揮抗胰島素抵抗作用。結(jié)論 ?燈盞花素可能通過多靶點、多途徑發(fā)揮改善胰島素抵抗的作用，為深入開展其作用機制研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);燈盞花素;胰島素抵抗;作用機制;分子對接

中圖分類號：R259.87;R285.5 ???文獻標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）11-0085-05

Abstract： Objective To probe into the interaction between breviscapine and targets associated with insulin resistance and its mechanism based on network pharmacology. Methods The main active components of breviscapine were determined by TCMSP databases and literature mining. Multiple databases were used to search and screen the corresponding targets of active components. The active components-target-disease network was constructed and its docking verification was conducted through the SystemsDock web site. The targets biological functions and related pathways were analyzed by DAVID. Results Verified by the database retrieval and literature， scutellarin was reported to be the main active component of breviscapine. Network topology analysis identified four potential key targets closely related to insulin resistance therapy （including NOS3， PTPN1， ADORA1， and PRKCG）， participating in biological processes such as metabolic regulation， inflammatory reaction， metabolism of organic nitrogen compounds. Anti-insulin resistance was exerted by intervention of related signaling pathways such as PI3K-Akt， Ras， insulin resistance and HIF-1. Conclusion Breviscapine may improve the role of insulin resistance through multiple targets and pathways， which can provide a scientific basis for further research on its mechanism.

Keywords： network pharmacology; breviscapine; insulin resistance; mechanism; molecular docking

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指組織器官或組織細胞對胰島素的生物調(diào)節(jié)作用不敏感或無反應(yīng)而導(dǎo)致正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)，是心血管疾病相關(guān)的糖尿病、冠心病、肥胖、高脂血癥等代謝性疾病的共同核心關(guān)鍵因素[1-2]，改善IR對心血管疾病的防治具有極其重要的意義。IR發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種因素的相互作用、相互影響且大多具有多基因相關(guān)性，使用單一靶點的藥物無法實現(xiàn)對IR的有效控制，由此，進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究具有重要意義[3-6]。

燈盞花素（breviscapine）是燈盞花經(jīng)醇提后的總黃酮成分，具有抗氧化、抗血栓、保護腦組織等廣泛的藥理作用，臨床用于腦血栓、心絞痛、動脈硬化等缺血性心腦血管疾病及糖尿病的治療[7]，已有研究表明，燈盞花素能調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂，增強胰島素敏感性，對IR有一定療效[8-9]，但其具體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制尚不明確。鑒于IR發(fā)生機制的復(fù)雜性及燈盞花素作用的廣泛性，推測燈盞花素的作用具有多靶點可能性，為進一步探討燈盞花素改善IR的分子機制，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，借助靶點預(yù)測、分子對接等技術(shù)，通過構(gòu)建燈盞花素活性成分與IR相關(guān)靶點之間的多層次作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合其改善疾病的主要通路，在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的層面綜合分析燈盞花素改善IR的作用機制，為后續(xù)實驗驗證奠定基礎(chǔ)，并為臨床用藥提供依據(jù)。

1 ?資料與方法

1.1 ?藥物活性成分確定及潛在靶點篩選

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、中藥化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫（http：//cowork.cintcm.com/engine/ search？channelid=58730），獲取已報道的燈盞花素化學(xué)成分，進一步查閱相關(guān)文獻，確定燈盞花素主要活性成分。

經(jīng)TCMSP獲取活性分子的毒藥物動力學(xué)（ADME）性質(zhì)，即對其口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）進行評估（OB≥2.64%、DL≥0.79），利用Pubchem數(shù)據(jù)庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）結(jié)合文獻挖掘?qū)Ψ肿咏Y(jié)構(gòu)進行確證。

采用反向藥效團對接（PharmMapper，http：//59.78.96.61/pharmmapper/）、藥物相似性搜索（STITCH，http：//stitch.embl.de/）、GeneCards（https：// www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫預(yù)測和篩選活性分子對應(yīng)靶點，去除重復(fù)和假陽性靶點基因，得到燈盞花素改善IR的潛在靶點數(shù)據(jù)集。

1.2 ?疾病靶點篩選

通過Cytoscape3.6.1軟件的DisGeNET插件搜索與IR相關(guān)的靶點基因，其數(shù)據(jù)來源包括人類基因和基因表型綜合數(shù)據(jù)庫（OMIM）、國際遺傳藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（PharmGkb）、毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（CTD，http：//ctdbase.org/）等多個數(shù)據(jù)庫，可靠性較高[10]。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫及文獻資料進行篩選驗證，去除重復(fù)數(shù)據(jù)，得到IR相關(guān)靶點數(shù)據(jù)集。

1.3 ?網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將上述得到的不規(guī)范的靶點名稱通過UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）整理靶點基因名，去掉重復(fù)項，用于后續(xù)分析。以藥物活性成分、成分對應(yīng)靶點、藥物相關(guān)疾病、IR相關(guān)靶點四者為節(jié)點，建立對應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建活性成分-靶點-疾病，網(wǎng)絡(luò)并利用其插件Network Analyzer進行分析[11]，觀察藥物與疾病靶點的相互作用情況，以確定其潛在關(guān)鍵作用靶標(biāo)。

1.4 ?分子對接驗證

分子對接技術(shù)是確認分子與靶點有效作用的途徑[12-13]，通過UniProt數(shù)據(jù)庫獲取所得潛在關(guān)鍵靶標(biāo)X射線晶體結(jié)構(gòu)的PDB編號，利用SystemsDock web site（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/ index）[14]對關(guān)鍵靶標(biāo)與燈盞花素的活性成分進行分子對接驗證，用以評價活性小分子與靶點之間的結(jié)合活性。

1.5 ?生物學(xué)過程和信號通路富集分析

將得到的活性分子靶點數(shù)據(jù)集導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行GO（gene ontology）生物學(xué)過程[15]和KEGG通路富集分析，再通過CTD數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻查閱，以閾值P<0.05篩選整合排名靠前的生物學(xué)過程或通路。

2 ?結(jié)果

2.1 ?藥物活性成分及靶點

通過TCMSP、Pubchem等數(shù)據(jù)庫及文獻挖掘確定燈盞花素主要成分為燈盞乙素（Scutellarin）和少量燈盞甲素，燈盞乙素是其主要活性單體，含量>95%，對其進行ADME計算發(fā)現(xiàn)，燈盞乙素的OB值較低，需要大劑量多次給藥，提示在制劑開發(fā)中需要注意劑型選擇問題。此外，由于本實驗要求目標(biāo)化合物須為中藥中的活性成分，故對燈盞甲素不做深入研究。

基于預(yù)測軟件及專業(yè)靶點數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)合文獻調(diào)研，去重后得到燈盞乙素潛在作用靶點121個，篩選驗證后得到與燈盞花素改善IR可能的相關(guān)作用靶點42個，檢索到與IR相關(guān)的靶點基因222個，最終匹配得到靶點數(shù)據(jù)集69個。

2.2 ?網(wǎng)絡(luò)可視化分析

通過對所構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的分析，可得網(wǎng)絡(luò)的一般特征及對藥物治療疾病作用機制的初步認識，進一步探索與藥物、疾病相關(guān)的作用途徑[11，16]。燈盞花素活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)見圖1。

該網(wǎng)絡(luò)共包含121個節(jié)點和132條邊線，網(wǎng)絡(luò)密度（network density）、網(wǎng)絡(luò)中心度（network centralization）、網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性（network heterogeneity）分別為0.017、0.567、3.823，不同顏色的節(jié)點分別代表藥物活性成分、靶點和相關(guān)疾病，邊線表示各節(jié)點之間的相互作用關(guān)系。通過網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，選擇度和介數(shù)均大于平均值的靶點作為關(guān)鍵作用靶點（見表1），提示燈盞花素可能通過這些靶點具有潛在的改善IR的作用。

2.3 ?分子對接

將所得潛在關(guān)鍵靶點的PDB編號導(dǎo)入SystemsDock web site并與燈盞花素活性成分進行對接，結(jié)果見表2。此對接方法所得分數(shù)是實驗解離/抑制常數(shù)值的負對數(shù)（pKd/pKi），通常為0～10（即從弱到強結(jié)合），允許直接指示結(jié)合強度。通常認為，對接打分>4.25說明分子與靶點之間有一定的結(jié)合活性，>5.0說明分子與靶點有較好的結(jié)合活性，>7.0說明分子與靶點具有強烈的結(jié)合活性[14，17]。對接結(jié)果顯示，燈盞乙素與靶點的對接分數(shù)均介于5.0～7.0，表明燈盞花素活性成分與關(guān)鍵靶點具有較好的結(jié)合活性。另外，經(jīng)文獻查證，上述重要靶點在IR的發(fā)生發(fā)展過程中均存在直接或間接的關(guān)系，說明該研究方法具有一定的科學(xué)性。

2.4 ?主要生物學(xué)過程

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對燈盞花素的活性成分燈盞乙素對應(yīng)靶點的生物功能進行分析，并以P<0.05篩選整合排名靠前的生物學(xué)過程，富集度較高的前20個生物學(xué)過程見表3。燈盞花素的靶點基因大多富集在細胞凋亡及分化的調(diào)節(jié)、代謝過程調(diào)控、對缺氧的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)過程、有機氮化合物代謝等過程中。

2.5 ?主要信號通路

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對燈盞乙素對應(yīng)靶點進行KEGG信號通路富集分析，借助Omicshare云平臺（http：//www.omicshare.com/）對排名靠前的通路進行整合繪制，按P值由小到大排列的前20條信號通路見圖2?？梢钥闯?，根據(jù)P<0.05的要求，燈盞花素主要參與VEGF、HIF-1、PI3K-Akt、Ras等信號通路，涉及其他通路有花生四烯酸代謝、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE通路等，其中PI3K-Akt、Insulin resistance、Ras、HIF-1信號通路與IR的發(fā)生密切相關(guān)，這表明燈盞花素作用靶點分布于不同的代謝通路，相互協(xié)調(diào)、共同調(diào)節(jié)是其改善IR的可能作用機制。

3 ?討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建了燈盞花素改善IR的活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，分析了藥物成分、靶點與疾病之間的相互作用關(guān)系，并對活性分子與其潛在關(guān)鍵作用靶點進行了對接打分、GO生物學(xué)過程和KEGG通路富集分析。富集分析結(jié)果顯示：燈盞花素通過調(diào)控細胞代謝、炎癥反應(yīng)等生物過程在細胞內(nèi)細胞器等部位發(fā)揮離子/蛋白/信號受體結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性激活等分子功能;富集所得通路中，PI3K-Akt、Ras、Insulin resistance等信號通路與IR的發(fā)生及治療密切相關(guān)，此外還得到與癌癥、細胞增殖與凋亡等相關(guān)的通路。

網(wǎng)絡(luò)拓撲分析發(fā)現(xiàn)，NOS3、PTPN1、ADORA1、PRKCG在燈盞花素改善IR作用中起重要作用。研究表明，NOS3基因是IR發(fā)生的基因標(biāo)志之一，藥物通過PI3K途徑增加內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達水平，調(diào)節(jié)胰島素受體后信號分子的異常，從而減輕細胞等組織的IR[18];胰島素信號傳導(dǎo)負調(diào)節(jié)因子PTP1B編碼基因PTPN1參與胰島素信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控，其通過IRS1的酪氨酸殘基去磷酸化作用干預(yù)PI3K-Akt信號通路，從而對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進行負調(diào)節(jié)[19-20];在Western diet高脂小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，ADORA1缺失會加重非酒精性脂肪肝和IR，促進肥胖的產(chǎn)生[21]。由此可見，IR的發(fā)生發(fā)展與這些關(guān)鍵靶點可能存在直接或間接聯(lián)系，而燈盞花素改善IR可能涉及多個過程和通路的協(xié)同作用，這與文獻報道的燈盞花素具有廣泛藥理活性相一致。

上述研究結(jié)果盡管體現(xiàn)了燈盞花素多靶點、多通路改善IR的作用特點，但因目前有關(guān)燈盞花素改善IR作用機制研究報道較少，加之網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)有關(guān)疾病和藥物數(shù)據(jù)庫信息資源的局限性，使文獻報道的實驗數(shù)據(jù)可能與數(shù)據(jù)庫實際收錄信息存在偏差，隨著科研不斷深入及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的進步，與疾病治療和藥物作用相關(guān)的新靶點將不斷被發(fā)現(xiàn)。此外，燈盞花素作為一類中藥單體具有廣泛的藥理作用及臨床應(yīng)用，其作用靶點之間是否具有相似性還未可知，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進行研究，可預(yù)測藥物可能的作用靶點及作用途徑，較全面地進行作用機制分析，增強實驗?zāi)康男裕瑴p少實驗資源的消耗，為進一步開展燈盞花素改善IR的實驗研究及臨床新用途的研究與開發(fā)提供依據(jù)。

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（收稿日期：2018-12-16）

（修回日期：2019-02-12;編輯：陳靜）