馬小敏 蔡芮桐 高銘陽(yáng)

【摘 要】 目的：觀察苦蕎麥總黃酮對(duì)2型糖尿病大鼠胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中GSK-3β與AKt基因與蛋白表達(dá)情況的影響。方法：雄性wistar大鼠鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立T2DM 模型，將T2DM模型大鼠隨機(jī)分為5組：模型組、苦蕎麥總黃酮低劑量組（50 mg/kg）、苦蕎麥總黃酮中劑量組（100 mg/kg）、苦蕎麥總黃酮高劑量組（200 mg/kg）、西藥組（二甲雙胍100 mg/kg），另外設(shè)置對(duì)照組。灌胃給藥后，采用ELISA法測(cè)胰島素水平、血糖水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù);采用RT-PCR法檢測(cè)大鼠肝組織中GSK-3β、Akt的mRNA表達(dá)情況;采用Western-blot法測(cè)定大鼠肝組織中GSK-3β、AKT的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與模型組相比，苦蕎麥總黃酮可降低大鼠肝組織中GSK-3βmRNA和蛋白表達(dá)（P<0.05）、增加Akt mRNA和蛋白表達(dá)（P<0.05）。結(jié)論：苦蕎麥總黃酮能降低模型大鼠肝組織中GSK-3βmRNA和蛋白表達(dá)、增加Akt mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)而起到積極的影響作用。

【關(guān)鍵詞】 苦蕎麥總黃酮;2型糖尿病;胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;糖原合成激酶-3β;蛋白激酶B

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285.5 ??【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ???【文章編號(hào)】1007-8517（2019）18-0015-07

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）是一種發(fā)病率極高的代謝性疾病，已嚴(yán)重影響人類(lèi)生活。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（the International Diabetes Federation，IDF）發(fā)布的第八版全球糖尿病地圖數(shù)據(jù)顯示，2017年全球共有4.25億糖尿病患者，其中中國(guó)患病人數(shù)最多[1]，90%～95%為2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）[2]。T2DM的病理機(jī)制與胰島β細(xì)胞功能失常和胰島素抵抗關(guān)系十分密切，其在環(huán)境、遺傳等因素的影響下通常表現(xiàn)為胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）[3]。糖原合成激酶-3β（Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）是胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，它在細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)會(huì)引起胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，引起IR[4-7]，有實(shí)驗(yàn)表明抑制GSK-3β活性可改善小鼠的糖耐量水平，使肝糖原代謝增加進(jìn)而增加肝糖原含量[8]。在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，激活的蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）可使GSK-3β磷酸化從而失活達(dá)到降血糖的目的。因此，促進(jìn)Akt表達(dá)從而抑制GSK-3β可以減輕胰島素抵抗，改善糖耐量水平，產(chǎn)生潛在的抗糖尿病效果[9]。

苦蕎麥作為一種藥食兩用的植物，在國(guó)內(nèi)外被廣泛種植[10]。其黃酮類(lèi)化合物在醫(yī)藥保健方面具有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力及保護(hù)心腦血管等多種功效[11-12]。研究通過(guò)觀察苦蕎麥總黃酮對(duì)Ⅱ型糖尿病胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中GSK-3β和Akt基因與蛋白的表達(dá)情況的影響，測(cè)定各組大鼠肝組織中mRNA與蛋白含量，探討苦蕎麥總黃酮對(duì)Ⅱ型糖尿病影響的作用與機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物與飼料 SPF級(jí)wistar大鼠78只，雄性，許可證號(hào)SCXK（遼）2015-0001 遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。高脂飼料和普通飼料（沈陽(yáng)市于洪區(qū)前民動(dòng)物實(shí)驗(yàn)飼料廠）;豬油和蔗糖（沈陽(yáng)市和平區(qū)金味源食品批發(fā)部）。

1.2 藥品與試劑 苦蕎麥總黃酮（日本三益制藥株式會(huì)社，含量為991.65 mg/g）;二甲雙胍（批號(hào)：20150617，沈陽(yáng)維康醫(yī)藥連鎖有限公司）;鏈脲佐菌素（批號(hào)：1122F032，solarbio）;胰島素ELISA試劑盒;氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇（20150607）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;RT-PCR試劑盒（AK5701），核酸Marker（A801A），上、下游引物（CHPA194）; SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號(hào)：20151222，Solarbio）;NC膜（批號(hào)：T426062，Pall）;TBS緩沖劑（批號(hào)：60900120）、蛋白ladder（批號(hào)：69J00157）購(gòu)自北京鼎國(guó)公司; SDS-PAGE電泳粉（批號(hào)：20161111）、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20160629）購(gòu)自凱基生物;蛋白提取試劑盒（批號(hào)：20160622）， GSK-3β（批號(hào)：0003）、Akt（批號(hào)：0020）、GAPDH（批號(hào)：0010）均為CST公司;HRP標(biāo)記抗兔二抗（批號(hào)：0026，CST公司）。

1.3 儀器 ACCU-CHEK血糖儀（羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）;ACCU-CHEK血糖試紙（羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）;iMark酶標(biāo)儀（美國(guó)BD）;JD500-3電子天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）;DW-HL388超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司）;HR/T20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）;HE-90水平電泳槽、VE-180垂直電泳槽均為上海天能科技有限公司;S1000 Thermal Cycler梯度PCR儀（BIO-RAD）;Chemi XR5凝膠成像分析儀;化學(xué)發(fā)光儀。

2 方法

2.1 試劑配制

2.1.1 鏈脲佐菌素（STZ）注射液 將檸檬酸（2.585 g）、檸檬酸三鈉（2.265 g）用150 mL三蒸水溶解，用HCL調(diào)pH至4.2后用三蒸水定容至200 mL，4℃儲(chǔ)存。使用時(shí)加STZ配成濃度為2%STZ溶液，注意用濾膜除菌。

2.1.2 Western blot緩沖液的配制

2.1.2.1 TBS存儲(chǔ)液 粉劑常溫存放，使用時(shí)直接用純水稀釋成1 L的存儲(chǔ)液。

2.1.2.2 TBST洗液 由1L TBS存儲(chǔ)液加入0.5 mL吐溫混勻制成。

2.1.2.3 轉(zhuǎn)膜液 配轉(zhuǎn)膜液由粉劑在配液時(shí)加熱，并用純水定容至800 mL，再加200 mL甲醇混勻而成。

2.1.2.4 封閉液 封閉液濃度為5%，即用5 g奶粉加100 mL純水制成。

2.2 動(dòng)物模型建立 雄性wistar大鼠于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng)（豬油及蔗糖）3 d后，隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組（普通飼料）7只，高脂飼料組（高脂飼料）71只（分籠飼養(yǎng)，每籠7只），喂養(yǎng)8周。喂養(yǎng)8周后，高脂飼料組按體質(zhì)量篩選出成為食源性肥胖的大鼠（標(biāo)準(zhǔn)：高脂飼料組個(gè)體質(zhì)量≥對(duì)照組個(gè)體質(zhì)量均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差）后，繼續(xù)喂養(yǎng)4周?？崭?fàn)顟B(tài)下用氧化酶法測(cè)定各組大鼠血糖;同時(shí)眶靜脈取血，用ELISA法檢測(cè)胰島素水平。計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（ISI）=1/（FINSxFBG）（FINS為空腹胰島素，F(xiàn)PG為空腹血糖）。將對(duì)照組與高脂飼料組進(jìn)行對(duì)照，篩選建立高脂飼料組大鼠胰島素抵抗模型。建模后對(duì)高脂飼料組大鼠進(jìn)行連續(xù)2周腹腔注射鏈脲佐菌素，劑量為25 mg/kg·周。再次測(cè)量空腹血糖，以空腹血糖>11.1 mmol/L視為造糖尿病模型造模成功[13-14]。

2.3 動(dòng)物分組 除對(duì)照組外，將糖尿病造模成功大鼠隨機(jī)分5組，分別為模型組7只;4個(gè)用藥組分別為苦蕎麥總黃酮低劑量組7只（用藥量50 mg/kg）;苦蕎麥總黃酮中劑量組7只（用藥量100 mg/kg）;苦蕎麥總黃酮高劑量組7只（用藥量200 mg/kg）;西藥組7只（二甲雙胍100 mg/kg）。灌胃給藥4周后，再次眶靜脈取血后處死各組大鼠，提取肝組織。

2.4 指標(biāo)測(cè)定及方法 給予高脂飼料8周后測(cè)量大鼠體重;給予大鼠注射STZ前，用ELISA法和氧化酶法分別測(cè)量大鼠的胰島素和血糖水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)。具體方法：準(zhǔn)備96孔加樣板，試劑盒室溫平衡30 min后，將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記二抗和酶標(biāo)試劑，置于37℃水浴中反應(yīng)60 min;洗板5次，加入試劑盒中顯色液A 50μL和B 50 μL，37℃水浴中反應(yīng)10 min;加入終止液50 μL后于10 min內(nèi)放入酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下讀取OD值并計(jì)算;給予注射STZ 2周后用ELISA法測(cè)胰島素水平和血糖水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)。方法同前。

2.4.1 RT-PCR法檢測(cè)大鼠肝組織中GSK-3β、Akt的mRNA表達(dá)情況

2.4.1.1 分離RNA 于冰盤(pán)上取100 mg大鼠肝組織，用預(yù)冷生理鹽水沖洗后剪碎，放入勻漿器內(nèi)，加入1 mL Trizol試劑勻漿裂解細(xì)胞。靜止5 min后，轉(zhuǎn)移裂解液到EP管中，加入0.2 mL氯仿，劇烈搖動(dòng)混勻。4℃靜置5 min后、12 000 rpm離心15 min。用移液器將水相轉(zhuǎn)移到新管中，加入等體積異丙醇混勻，靜置10 min。再次4℃、12 000 rpm離心10 min。去上清，加入1 mL 75%乙醇混勻，靜置5 min。第3次4℃、 1 2000 rpm離心5 min。分離出RNA，倒掉乙醇，靜置5 min后加入30μL DEPC水溶解，得到RNA溶液。取12μL RNA溶液，加入 DEPC 水稀釋?zhuān)妹笜?biāo)儀測(cè)定260 nm 和280 nm的吸光度，并計(jì)算RNA的濃度和純度。

2.4.1.2 反轉(zhuǎn)錄出mRNA 按TAKARA試劑盒說(shuō)明書(shū)要求配制10μL反轉(zhuǎn)錄體系，于PCR儀中42～60℃條件下放置15～30 min，95℃條件下5 min，5℃條件下5 min;再配制PCR反應(yīng)液40μL，把此反應(yīng)液加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束的PCR反應(yīng)管中，輕輕混勻，離心約10s，進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃進(jìn)行30sec，55～65℃進(jìn)行30sec，上述兩步驟重復(fù)30Cycles，然后72℃進(jìn)行50sec。準(zhǔn)備上樣。在上述RT-PCR過(guò)程中用到的上、下游引物及合成序列長(zhǎng)度如下：GSK-3β的上游引物序列為5′-TCGTCCATCGATGTGTGGTC-3′，下游引物序列為5′-TTGTCCAGGGGTGAGCTTTG-3′，合成長(zhǎng)度為202bp，退火溫度為60℃;Akt的上游引物序列為5′- AGAGAGCCGAGTCCTACAGAATA-3′，下游引物序列為5′-CCGAGAGAGGTGGAAAAACA-3′，合成長(zhǎng)度為133bp，退火溫度為61℃;GAPDH的上游引物序列為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物序列為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，合成長(zhǎng)度為500bp，退火溫度為60℃。

2.4.1.3 凝膠成像 制備1.5%瓊脂糖凝膠，放入電泳槽中。取5 μL樣本和1 μL上樣緩沖液，混合成6 μL上樣液。瓊脂糖凝膠上樣后接通電源，110V，約1 h。放入凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶。

2.4.2 Western-blot法測(cè)定大鼠肝組織中GSK-3β、AKT的蛋白表達(dá)情況

2.4.2.1 蛋白樣品制備 取100 mg肝組織，于冰上在EP管內(nèi)剪碎，加入裂解液，用超聲破碎儀充分勻漿裂解。將勻漿裂解液在離心機(jī)中4℃、14 000 rpm離心10 min;將上清液轉(zhuǎn)移至新的冰上預(yù)冷的1.5 mL EP管中，得到全蛋白提取物，可以進(jìn)行蛋白定量。

2.4.2.2 BCA法測(cè)定蛋白含量 按說(shuō)明書(shū)將蛋白樣本稀釋。試劑A：試劑B（50∶ 1）配制，計(jì)算樣本濃度。使每孔上樣蛋白量達(dá)40 μg，混勻后置沸水浴5 min。10 000 rpm轉(zhuǎn)1 min后直接取上清液上蛋白樣本。

2.4.2.3 電泳 配10%分離膠。配5%濃縮膠，膠液加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，然后將梳子水平插入，4℃靜置2h。將其放入電泳槽中，分別加入樣本和ladder。電泳時(shí)樣本在濃縮膠時(shí)恒壓80V，在分離膠時(shí)恒壓120V。取膠，將膠放置在含有轉(zhuǎn)膜液的托盤(pán)內(nèi)。

2.4.2.4 轉(zhuǎn)膜 在冰盆中濕轉(zhuǎn)，1L濕轉(zhuǎn)液。將夾子放入轉(zhuǎn)膜槽中。恒壓100V，78 min定時(shí)。

2.4.2.5 封閉 根據(jù)目的蛋白分子量將膜剪成細(xì)條放入封閉盒內(nèi)，加5%的封閉液，放入水浴箱內(nèi)，37℃，緩慢振蕩1.5h。倒掉封閉液，TBST于搖床上洗3次，每次3 min。

2.4.2.6 抗體孵育與免疫反應(yīng) 一抗滴加于膜上，室溫下輕搖孵育1h后4℃靜置過(guò)夜;膜用TBST洗3次，每次10 min于搖床上;加入稀釋二抗后放于37℃水浴中1 h;TBST洗3次，每次10 min。

2.4.2.7 化學(xué)發(fā)光 將發(fā)光液試劑盒按比例于EP管中混勻，滴加于膜上，放入發(fā)光儀進(jìn)行曝光并拍照。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS 16.0 軟件，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異顯著性檢驗(yàn)用t檢驗(yàn)，單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 飼養(yǎng)8周后各組大鼠體重的變化 各高脂飼料組與對(duì)照組相比較，大鼠體重明顯增加（P<0.05），成功篩選出食源性肥胖大鼠。見(jiàn)表1。

3.2 飼養(yǎng)12周后各組大鼠胰島素敏感指數(shù)的變化 各高脂飼料組與對(duì)照組相比較，大鼠胰島素敏感指數(shù)明顯下降（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3.3 飼養(yǎng)12周后各組大鼠血液中胰島素水平的變化 各組間經(jīng)兩兩比較，血液中胰島素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

3.4 給予藥物干預(yù)后各組大鼠血糖水平的變化 模型組與對(duì)照組相比較，大鼠血糖水平明顯提高（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮低、中、高劑量組、西藥組與模型組相比較，大鼠血糖水平明顯下降（P<0.05），其中苦蕎麥中劑量組與西藥組降血糖效果較好。見(jiàn)表4。

3.5 給予藥物干預(yù)后各組大鼠血液中胰島素水平的變化 模型組與對(duì)照組相比較，大鼠胰島素水平明顯下降（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮低、中劑量組、西藥組與模型組相比較，大鼠胰島素水平明顯提高（P<0.05），其中苦蕎麥中劑量組、西藥組與對(duì)照組胰島素水平相近。見(jiàn)表5。

3.6 給予藥物干預(yù)后各組大鼠胰島素敏感指數(shù)的變化 模型組與對(duì)照組相比較，大鼠胰島素敏感指數(shù)明顯下降（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮中、高劑量組、西藥組與模型組相比較，大鼠胰島素敏感指數(shù)明顯提高（P<0.05），其中苦蕎麥中劑量組與西藥組大鼠胰島素敏感指數(shù)與對(duì)照組相近。見(jiàn)表6。

3.7 各組大鼠肝組織中GSK-3β mRNA的相對(duì)表達(dá)情況 與對(duì)照組相比較，模型組組織中GSK-3β mRNA的表達(dá)明顯提高（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮中劑量組、西藥組和模型組相比較，GSK-3βmRNA的表達(dá)明顯下降（P<0.05）。如圖1所示，見(jiàn)表7。

3.8 各組大鼠肝組織中Akt mRNA的相對(duì)表達(dá)情況 與對(duì)照組相比較，模型組組織中Akt mRNA 的表達(dá)明顯減少（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮中劑量組、西藥組和模型組相比較，Akt mRNA 的表達(dá)明顯增加（P<0.05）。如圖2所示，見(jiàn)表8。

3.9 各組大鼠肝組織中GSK-3β蛋白的相對(duì)表達(dá)情況 模型組與對(duì)照組相比較，組織中GSK-3β蛋白的表達(dá)明顯增加（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮中劑量組、西藥組與模型組相比較，GSK-3β蛋白的表達(dá)明顯減少（P<0.05）。如圖3所示，見(jiàn)表9。

3.10 各組大鼠肝組織中AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)情況 模型組與對(duì)照組相比較，組織中AKT蛋白的表達(dá)減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮中劑量組、西藥組與模型組相比較，AKT蛋白的表達(dá)增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。如圖4所示，見(jiàn)表10。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦蕎麥總黃酮低、中、高3個(gè)劑量組中，中劑量組效果最好。和模型組相比較，苦蕎麥總黃酮中劑量組與西藥組在控制T2DM大鼠血糖方面效果顯著，可明顯提高T2DM大鼠胰島素水平，提高其胰島素敏感指數(shù)。證明苦蕎麥總黃酮對(duì)T2DM大鼠的病情有積極影響，其機(jī)制與苦蕎麥總黃酮能使胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中GSK-3βmRNA和蛋白表達(dá)減少、Akt mRNA和蛋白表達(dá)增加有關(guān)。

研究表明，多數(shù)T2DM患者存在IR[15]，降低IR是治療T2DM的關(guān)鍵[16]，IR與胰島素作用調(diào)節(jié)通路有關(guān)[17]。胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中激活的Akt使 GSK-3β磷酸化而失活[18]，阻止GSK-3β對(duì)其底物糖原合成酶的磷酸化作用，糖原合成酶去磷酸化后恢復(fù)活性，發(fā)揮糖原合成作用，減少細(xì)胞中葡萄糖濃度。并且GSK-3β影響糖原合成酶活性不受胰島素濃度影響[19]。同時(shí)有實(shí)驗(yàn)表明使用高選擇性抑制劑抑制GSK-3β 活性可增加葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)從而提高胰島素的活性[20]，減少I(mǎi)R，進(jìn)而達(dá)到降血糖作用。

因此，可以肯定激活A(yù)kt基因與蛋白表達(dá)、抑制GSK-3β基因與蛋白表達(dá)對(duì)降低T2DM大鼠血糖水平，升高胰島素敏感指數(shù)及改善胰島素抵抗有一定效果?？嗍w麥總黃酮通過(guò)影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中GSK-3β與Akt兩個(gè)基因與蛋白的表達(dá)影響T2DM大鼠。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選擇使用鏈脲佐菌素（STZ）選擇性破壞動(dòng)物胰島β細(xì)胞從而導(dǎo)致糖尿病[21-22]，目前國(guó)內(nèi)廣泛采用高脂高糖飲食聯(lián)合注射小劑量STZ建立T2DM模型，該模型具有高血糖、胰島素抵抗等特點(diǎn)，與人類(lèi)糖尿病發(fā)病過(guò)程和發(fā)病機(jī)理相似[23]?？嗍w麥作為一種藥食同源的植物，在改善T2DM的血糖水平，胰島素抵抗方面，有一定的開(kāi)發(fā)潛力。

參考文獻(xiàn)

[1]International Diabetes Federation. Diabetes Atlas Eighth Edition[Internet]. http：//www.diabetesatlas.org， 2017.

[2]葛均波，徐永健，王辰.內(nèi)科學(xué)[M].9 版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2018：128.

[3]Nadarajan Sarega，Mustapha Umar Imam，Norhaizan Md Esa，et al. Effects of phenolic-rich extracts of Clinacanthus nutans on high fat and high cholesterol diet-induced insulin resistance[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine，2016，16（1）：88.

[4]GAO Chong，Hlscher Christian，LIU Yueze，et al. GSK3： a key target for the development of novel treatments for type 2 diabetes mellitus and Alzheimer disease[J]. Reviews in the neurosciences，2012，23（1）：1-11.

[5]Lappas M.GSK3β Is Increased in adipose tissue and skeletal muscle from women with gestational diabetes where it regulates the inflammatory response [J].Plos One，2014，9（12）：e115854.

[6]ZHANG T，F(xiàn)ANG M，F(xiàn)U Z M，et al.Expression of PI3-K，PKB and GSK-3 β in the skeletal muscle tissue of gestational diabetes mellitus [J]. Asian Pac J Trop Med，2014，7（4）：309-312.

[7]Motawi T M，Bustanji Y，Elmaraghy S A，et al.Naproxen and cromolyn as new glycogen synthase kinase 3β inhibitors for amelioration of diabetes and obesity： an investigation by docking simulation and subsequent in vitro/in vivo biochemical evaluation[J]. J Biochem Mol Toxicol，2013，27（9）：425-436.

[8]WU J， CHEN M， SHI S， et al. Hypoglycemic effect and mechanism of a pectic polysaccharide with hexenuronic acid from the fruits of， Ficus pumila， L. in C57BL/KsJ db/db mice[J]. Carbohydrate Polymers， 2017 （178）：209-220.

[9]王薪寧，徐斌，周金培，等.基于新靶點(diǎn)的抗糖尿病藥物研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46（2）： 141-152.

[10]Walter R. Jaffé. Health Effects of Non-Centrifugal Sugar （NCS）： A Review[J]. Sugar Tech， 2012， 14（2）：87-94.

[11]扶慶權(quán).正交試驗(yàn)法優(yōu)化苦蕎總黃酮的提取工藝[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（9）：2138-2140.

[12]黃萍，何兵，劉艷，等.不同來(lái)源的苦蕎茶中4種黃酮的含量測(cè)定[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2017，38（1）：135-138.

[13]高雪，安至超，何其英，等.高脂飼料喂養(yǎng)時(shí)間對(duì)2型糖尿病腎病大鼠模型的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2018，26（1）∶114-119.

[14]吳瑛，張勇，姚合斌.高脂聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素建立實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型[J].轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志，2017，6（6）∶355-57.

[15]吳國(guó)柱，楊士杰，蔣玉清，等.胰島素樣生長(zhǎng)因子-1在代謝綜合征大鼠和糖尿病大鼠膀胱中的表達(dá)變化[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015，32（9） ： 2199-2202.

[16]張洪梅.觀察葛根素對(duì)2型糖尿病患者胰島素抵抗的影響[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2018，18（21）：111.

[17]袁榮華，黃起壬，柯臨慧.胰島素抵抗機(jī)制的研究現(xiàn)狀和進(jìn)展[J].九江學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，25（4）：109-111.

[18]王夢(mèng)華，盧均坤.PI3K/Akt信號(hào)通路及其抑制劑的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)信息，2018，31（10）：34-36.

[19]T.P. Ciaraldi，L. Carter，S. Mudaliar，R.R. Henry. GSK-3β and control of glucose metabolism and insulin action in human skeletal muscle[J]. Molecular and Cellular Endocrinology，2009，315（1）：153-158.

[20]Erik J Henriksen. Dysregulation of Glycogen Synthase Kinase-3 in Skeletal Muscle and the Etiology of Insulin Resistance and Type 2 Diabetes[J]. Current Diabetes Reviews，2010，6（5）： 285-293.

[21]招少楓，江鐘立，王磊.飲食和運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)2型糖尿病大鼠心肌Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2006（5）：393-397.

[22]WU Kenneth K，HUAN Youming. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats[J]. Current Protocols in Pharmacology，2008，Chapter 5.

[23]上官若男，朱斌，尚畫(huà)雨，等.改善Ⅱ型糖尿病大鼠糖代謝運(yùn)動(dòng)模型的建立[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2017，25（3）：275-280.

（收稿日期：2019-07-05 編輯：陶希睿）