陳 萌 路洪超 劉 鑠

(1 河北省民政總醫(yī)院普通外科，邢臺市 054000，電子郵箱：cmeng821028@sina.com；2 河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院乳腺中心，石家莊市 051000)

近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅女性的身心健康[1]。新輔助化療可以消除全身微轉(zhuǎn)移灶，提高保乳率，且化療后患者可獲得病理完全緩解，提高生存率，目前已成為局部晚期乳腺癌的標準化治療方案之一[2]。隨著分子生物學研究的發(fā)展,乳腺癌相關(guān)生物學因子表達在乳腺癌新輔助化療效果及預后評估中的價值越來越受重視。研究顯示，Ki-67是評價乳腺癌新輔助化療效果的敏感性指標[3]，乳腺癌組織中Ki-67高表達提示腫瘤增殖活躍，預后不良。本研究觀察新輔助化療后Ki-67表達變化及其與乳腺癌患者預后的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2007年1月至2010年1月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院乳腺中心，行新輔助化療的185例初治Ⅱb～Ⅲc期乳腺癌患者的臨床資料，均為女性，年齡29～71歲。納入標準：化療前經(jīng)空芯針活檢槍穿刺活檢確診為乳腺癌；影像學檢查提示無遠處轉(zhuǎn)移；新輔助化療后均行根治性手術(shù)治療；既往無針對腫瘤的放療、化療及內(nèi)分泌治療史；無化療禁忌證。排除標準：已存在遠處轉(zhuǎn)移、合并其他腫瘤、不配合治療者。年齡≤35歲共13例(7.0%)，>35歲共172例(93.0%)；絕經(jīng)103例(55.6%)；腫瘤<2 cm共26例(14.1%)，2～5 cm共105例(56.8%)，>5 cm共54例(29.2%)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移共125例(67.6%)；分子分型：Luminal A型共50例(27.0%)，Luminal B型共28例(15.1%)，三陰型共52例(28.1%),人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)過表達型共55例(29.7%)。

1.2 治療方法 根據(jù)患者年齡、病理類型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進行患者復發(fā)轉(zhuǎn)移風險評價，再結(jié)合患者的心臟狀況，經(jīng)濟狀況等選擇不同的化療方案。新輔助化療方案包括含蒽環(huán)類藥物治療方案與紫杉類聯(lián)合蒽環(huán)類藥物治療方案。兩種方案均治療3～4個周期。含蒽環(huán)類藥物治療方案：環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞有限公司，批號：100514AM)500 mg/m2、表柔比星(浙江海正有限公司，批號：10017811)100 mg/m2或吡柔比星(深圳萬樂有限公司，批號：08110925)60 mg/m2，于每一治療周期第1天靜脈注射，1次/周期，每21天為1個周期。紫杉類聯(lián)合蒽環(huán)類藥物治療方案為TE或TEC方案：(1)TE方案。表柔比星75 mg/m2，于每一治療周期第1天靜脈注射，紫杉醇(揚子江藥業(yè)有限公司，批號：9L0714866)175 mg/m2或多西他賽(齊魯制藥有限公司，批號：8D0071649)75 mg/m2，于每一治療周期第2天靜脈注射；(2)TEC方案。在TE方案的基礎上，給予環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞有限公司，批號：090174TM)500 mg/m2，于每一治療周期第1天靜脈注射，1次/周期，每21天為1個周期。

1.3 Ki-67的檢測方法與結(jié)果判定 在化療前及化療4個周期后，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法檢測患者乳腺癌組織Ki-67表達水平，其中兔抗人Ki-67(克隆號：MIB-1)單克隆抗體購自福州邁新有限公司(批號：09061306)，生物素標記的二抗試劑盒購自北京中杉金橋公司(批號：09072404)。將腫瘤組織石蠟標本切4 μm厚切片置于載玻片上，置于60℃恒溫箱2 h后放置于37℃恒溫箱固片。將切片常規(guī)脫蠟：先用二甲苯洗浴10 min/次(共2次)，再經(jīng)100%乙醇洗浴5 min/次(共2次)，95%、80%梯度乙醇各洗浴5 min，清水沖洗2次，蒸餾水洗浴3 min。然后進行抗原熱修復，蒸餾水洗浴2 min/次(共3次)，將切片組織置于抗原修復液平面以下，蓋鍋壓閥。加熱5～6 min后，自開始噴氣時，計時2.5～3.0 min，停止加熱，然后將壓力鍋冷水降至室溫，取出切片后先后蒸餾水、磷酸鹽緩沖液沖洗，各2 min/次(共3次)，3%過氧化氫室溫孵育5～10 min，再以磷酸鹽緩沖液沖洗2 min/次(共3次)；滴加一抗，置于4℃冰箱過夜；磷酸鹽緩沖液洗浴2 min/次(共3次)；滴加二抗，室溫下孵育20 min，磷酸鹽緩沖液沖洗2 min/次(共3次)；滴加3,3-二氨基聯(lián)苯溶液顯色，顯微鏡下觀察，適度顯色時終止顯色反應；充分水洗，蘇木素復染；經(jīng)梯度乙醇脫水，樹膠封，鏡下閱片。采用已知為陽性染色切片作陽性對照，以磷酸鹽緩沖液作陰性對照。Ki-67為核表達，以細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標志。判斷標準如下[4]：Ki-67陰性(-)，即無棕黃色染色或染色陽性細胞數(shù)<10%；Ki-67陽性(+)，即染色陽性細胞數(shù)在10%～25%；Ki-67陽性(2+)，即染色陽性細胞數(shù)在26%～50%；Ki-67陽性(3+)，即染色陽性細胞數(shù)在>50%。對乳腺癌進行分子分型時，Ki-67染色陽性細胞數(shù)≥14%即為陽性，Ki-67染色陽性細胞數(shù)<14%即為陰性。

1.4 乳腺癌分子分型[5]依據(jù)免疫組化結(jié)果中雌激素受體(estrogen receptor，ER)/孕激素受體(progesterone receptor，PR)、HER-2和Ki-67表達水平的不同將乳腺癌分為4個亞型：Luminal A型(ER/PR陽性，Ki-67<14%，HER-2陰性)、Luminal B型包括[Luminal B1型(ER/PR陽性,Ki-67≥14%，HER-2陰性)和Luminal B2型(ER/PR陽性，HER-2陽性，Ki-67任何表達水平)]、HER-2過表達型(ER陰性，PR陰性，HER-2陽性，Ki-67任何表達水平)、和三陰性型(ER陰性，PR陰性，HER-2陰性，Ki-67任何表達水平)。

1.5 隨訪 隨訪截至2015年1月，隨訪方式為電話隨訪和門診復診。隨訪內(nèi)容包括：(1)是否繼續(xù)接受內(nèi)分泌治療、分子靶向治療等；(2)是否定期復查，以及生存狀況；(3)死亡患者明確死亡原因是否與乳腺癌相關(guān)。無復發(fā)生存(relapse-free survival，RFS)是指從術(shù)日起至首次診斷復發(fā)、死亡，或隨訪日期為止。RFS率=隨訪期內(nèi)無復發(fā)或死亡的例數(shù)/總例數(shù)×100%

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的計量資料用(x±s)表示，比較采用t檢驗，非正態(tài)分布的計量資料以[M(P25，P75)]表示，比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)或百分數(shù)表示，比較采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組中位RFS時間比較采用log-rank檢驗。以化療前Ki-67表達水平為基準，化療后Ki-67水平低于化療前為降低，高于化療前為升高。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Ki-67變化與分子分型的關(guān)系 185例患者化療后Ki-67表達水平低于化療前。其中Luminal B型、三陰性型、HER-2過表達型患者化療后Ki-67表達水平均低于化療前(均P<0.05)，而Luminal A型患者化療前后Ki-67表達水平的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 Ki-67變化與預后的關(guān)系 術(shù)后隨訪期間，185例患者中復發(fā)轉(zhuǎn)移46例，死亡11例，無復發(fā)生存128例。化療后Ki-67表達水平降低共133例，其中RFS 99例，RFS率為74.4%，中位RFS時間為71個月；未降低共52例，其中RFS 29例，RFS率為55.8%，中位RFS時間為57個月。Ki-67降低者RFS時間高于Ki-67未降低者(χ2=9.409，P=0.002)。見圖1。

表1 各分子分型和總體患者新輔助化療前后Ki-67表達比較[M(P25，P75)，%]

2.3 乳腺癌各分子亞型中Ki-67變化與預后的關(guān)系 Luminal A型患者50例，化療后Ki-67表達水平降低者29例，RFS率為79.3%(23/29)，中位RFS時間為75個月；未降低者21例，RFS率為71.4%(15/21)，中位RFS時間為68個月；Ki-67表達水平降低者和未降低者之間RFS時間的差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.649，P=0.420)，見圖2。Luminal B型患者28例，Ki-67表達水平降低者24例，RFS率為75.0%(18/24)，中位RFS時間為72個月；未降低者4例，RFS率為25.0%(1/4)，中位RFS時間為36個月；Ki-67表達水平降低者RFS時間高于未降低者(χ2=7.598，P=0.006)，見圖3。三陰性型患者52例，Ki-67表達水平降低者38例，RFS率為65.8%(25/38)，中位RFS時間為65個月；未降低者14例，RFS率為42.6%(6/14)，中位RFS時間為39個月；Ki-67表達水平降低者RFS時間高于未降低組(χ2=4.546，P=0.033)，見圖4。HER-2過表達型患者55例，Ki-67表達水平降低者42例，RFS率為78.6%(33/42)，中位RFS時間為74個月；未降低者13例，RFS率為53.8%(7/13)，中位RFS時間為59個月；Ki-67表達水平降低者RFS時間高于未降低者(χ2=3.973，P=0.046)，見圖5。

圖1 185例患者RFS曲線 圖2 Luminal A型患者RFS曲線

圖3 Luminal B型患者RFS曲線 圖4 三陰型患者RFS曲線

圖5 HER-2過表達型患者RFS曲線

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。早在20世紀60年代,就有學者提出乳腺癌是一種全身性疾病[6]。新輔助化療于1982年首次被提出,指在手術(shù)前或放療前進行的全身性、系統(tǒng)性細胞毒性藥物治療[7]。對于具有適應證的乳腺癌患者，實施新輔助化療可使其獲益，目前已達成共識[8]。然而，目前用于預測乳腺癌新輔助化療療效及預后的生物學指標，仍然沒有統(tǒng)一的標準,探討有關(guān)新輔助化療療效及預后的預測因子成為臨床關(guān)注的熱點[9]。

Ki-67是目前檢測腫瘤細胞增殖活性最可靠的指標之一[10]。研究表明，Ki-67在乳腺癌的診治與預后評估中均具有重要的臨床價值，其表達水平可作為預測乳腺癌對新輔助化療的反應以及選擇化療方案的重要分子生物學指標[11-12]。本研究結(jié)果顯示，185例患者化療后Ki-67表達水平低于化療前，化療后Ki-67表達降低組患者RFS率為70.6%，未降低患者RFS率為55.0%，Ki-67表達水平降低組RFS率高于未降低組(P<0.05)，即化療后Ki-67表達水平降低者有預后較好，與Focke等[13]研究結(jié)果相似。這提示化療后Ki-67表達水平的高低對評價乳腺癌細胞的增殖狀態(tài)、腫瘤的生物學行為、判斷其遠期生存具有重要意義。

Chen等[14]對225例接受新輔助化療的局部晚期乳腺癌患者進行隨訪，發(fā)現(xiàn)相較于Luminal A型與Luminal B型乳腺癌患者，三陰型和HER-2過表達型乳腺癌患者病理完全緩解率更高，但預后相對更差。目前，對于新輔助化療后不同乳腺癌分子亞型患者Ki-67表達水平變化與預后的關(guān)系，鮮有報道。本研究結(jié)果顯示，在Luminal A型患者中，化療后Ki-67降低者和未降低者之間RFS率的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而在Luminal B型、三陰性型和HER-2過表達型患者中，化療后Ki-67表達水平降低者RFS率均高于未降低者(均P<0.05)，提示在Luminal B型、三陰性型和HER-2過表達型乳腺癌患者中，新輔助化療前后Ki-67表達水平的變化可能是乳腺癌患者預后的影響因素。但本研究樣本量較小,有待在擴大樣本量以進一步驗證此結(jié)論。此外，本研究未將患者是否接受內(nèi)分泌及抗HER-2治療考慮在內(nèi)，而這可能會對研究結(jié)果產(chǎn)生一定影響，亟待行多因素分析研究進行更加深入的探討。