謝軍，韓造木，尹琬凌

微RNAs（miRNAs）在糖尿病及胰島素抵抗的發(fā)生過程中起重要作用，目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA通過各種作用方式導(dǎo)致或改善胰島素抵抗。作者前期研究發(fā)現(xiàn)miR-27a可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗［1］。本研究于2017年11月至2018年7月以腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗為模型，進(jìn)一步研究miR-27a介導(dǎo)胰島素抵抗的作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料3T3-L1前脂肪細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫，Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）高糖培養(yǎng)基購于美國(guó)Hyclone公司，胰蛋白酶購于bioswamp公司，胎牛血清（fetal bovine serum）購于美國(guó)Gibco公司，胰島素（Insulin），TNF-α，地塞米松（dexamethasone），異丁基甲基黃嘌呤（isobutyl methyl xanthine，IBMX）均購于美國(guó)sigma公司，脂質(zhì)體2000（Lipofectamine 2000）購于美國(guó)Invitrogen公司，SYBR Green PCR試劑盒購于美國(guó)KAPA Biosystems公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TAKARA公司。miR-27a類似物（mimics）和miR-27a抑制物（inhibitor）購于廣州銳博生物科技有限公司。胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1），蘇氨酸蛋白激酶（Akt），糖原合成激酶（GSK-3β）等細(xì)胞信號(hào)通路蛋白及其磷酸化活性形式p-IRS1，p-Akt，p-GSK-3β抗體均購于英國(guó)Abcam公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 3T3-L1細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立及miR-27a對(duì)葡萄糖攝取的影響3T3-L1前脂肪細(xì)胞在37℃，5%二氧化碳及飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)、傳代。試驗(yàn)時(shí)，將細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)匯合度達(dá)到70%時(shí)，用含誘導(dǎo)液（10 mg/L胰島素、1 μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤及10%胎牛血清）的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化48 h，撤掉地塞米松、IBMX，用含10 mg/L胰島素的DMEM培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h，然后換成含不含胰島素的10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基再繼續(xù)培養(yǎng)4 d，采用油紅O染色鑒定細(xì)胞的分化情況。向培養(yǎng)基中添加10 ng/L TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)24 h，即可成功建立3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型。

細(xì)胞分為正常對(duì)照組，模型組，miR-27a mimics+模型組，miR-27a inhibitor+模型組。將3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中，實(shí)驗(yàn)前1 d用含0.2%BSA的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞在37℃含0.2%BSA的KRB緩沖液［含120.0 mmol/L氯化鈉（NaCl），6.0 mmol/L氯化鉀（KCl），12.5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），1.2 mmol/L硫酸鎂（Mg-SO4），0.4 mmol/L磷酸二氫鈉（NaH2PO4），0.6 mmol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4），1.0 mmol/L氯化鈣（CaCl2）］中作用2 h，然后每孔加入含5微居里（μCi）脫氧3H葡萄糖的-脫氧葡萄糖混合液50 μL孵育5 min，然后吸去全部孵育液，冰磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細(xì)胞5次，干燥后室溫下每孔加入500 μL Triton-100裂解細(xì)胞30 min，最后取400 μL細(xì)胞裂解液于液閃計(jì)數(shù)器下檢測(cè)。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化 3T3-L1細(xì)胞分為正常對(duì)照組，模型組，miR-27a mimics+模型組，miR-27a inhibitor+模型組，分別以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)胰島素信號(hào)通路IRS1，Akt，GSK-3β的蛋白水平及蛋白磷酸化水平（活性形式）的變化。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測(cè)過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的表達(dá) 分別收集各組的3T3-L1細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，應(yīng)用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行qPCR。反應(yīng)體系按照說明書進(jìn)行配置。采用GAPDH作為內(nèi)參，根據(jù)qPCR反應(yīng)曲線得到各組樣品目的基因和內(nèi)參基因的Ct（Cycle threshold）值。首先計(jì)算△△C t值＝（實(shí)驗(yàn)組目的基因的Ct平均值－實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因的Ct平均值）－（對(duì)照組目的基因的Ct平均值－對(duì)照組目的內(nèi)參基因的Ct平均值），則基因相對(duì)表達(dá)量為2-△△Ct。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)miR-27a的靶點(diǎn) 利用pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)miR-27a對(duì)PPARγ的直接調(diào)控作用。克隆PPARγ 3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）區(qū)域，同時(shí)采用Quick Change XL Site-Directed Mutagenesis kit試劑盒設(shè)計(jì)miR-27a結(jié)合位點(diǎn)突變區(qū)域（即陰性對(duì)照），插入pmirGLO載體中，擴(kuò)增并抽提質(zhì)粒。然后利用lipofectamine 2000與miR-27a mimics或inhibitor以及對(duì)照共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后于熒光光度計(jì)下檢測(cè)熒光值以驗(yàn)證miR-27a對(duì)PPARγ 3’-UTR的直接作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有結(jié)果利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)采用xˉ±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析＋LSD法或成組t檢驗(yàn)，P＜0.01表示數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-27a對(duì)胰島素抵抗模型葡萄糖攝取的影響我們采用TNF-α法建立了3T3-L1胰島素抵抗的細(xì)胞模型，同時(shí)檢測(cè)了miR-27a對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型中的葡萄糖攝取的影響。結(jié)果顯示：正常對(duì)照組，模型組，miR-27a mimics+模型組，miR-27a inhibitor+模型組四組的吸光度值分別為（2.03±0.20），（1.28 ± 0.27），（1.43 ± 0.20），（1.97 ± 0.18），模型組成功抑制了3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，而miR-27a inhibitor則逆轉(zhuǎn)了模型組細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取的抑制。見圖1。

2.2 miR-27a對(duì)胰島素信號(hào)通路的影響胰島素和胰島素受體結(jié)合后會(huì)通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信號(hào)通路促進(jìn)葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低血糖。因此我們檢測(cè)了miR-27a對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響，結(jié)果顯示miR-27a mimics抑制了胰島素信號(hào)通路中IRS1、Akt、GSK-3β的磷酸化，而miR-27a inhibitor則恢復(fù)了模型組對(duì)IRS1、Akt、GSK-3β的磷酸化的抑制。見圖2。

圖1 miR-27a對(duì)葡萄糖攝取的影響（n＝3）

圖2 miR-27a對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞模型信號(hào)通路的影響：A為正常對(duì)照組；B為模型組；C為模型組+miR-27a mimics；D為模型組+miR-27a inhibitor

2.3 qPCR驗(yàn)證miR-27a對(duì)PPARγ的影響PPARγ在脂肪細(xì)胞分化及糖尿病的發(fā)病過程中起重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-27a可以抑制PPARγ的表達(dá)，通過qPCR我們檢測(cè)了miR-27a對(duì)PPARγ表達(dá)的影響。結(jié)果顯示對(duì)照組和mir-27a組的相對(duì)值分別為（1.00±0.08）和（0.59±0.14），miR-27a可以顯著抑制PPARγ的表達(dá)。見圖3。

圖3 miR-27a mimics抑制PPARγ mRNA的表達(dá)（n＝3）

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證miR-27a的靶點(diǎn) 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法是驗(yàn)證miRNA靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法驗(yàn)證PPARγ是否為miR-27a的靶點(diǎn)。結(jié)果顯示：miR-27a可以顯著抑制報(bào)告基因的表達(dá)，而miRNA的對(duì)照mir-NC及突變了結(jié)合位點(diǎn)的載體Mut均不能抑制報(bào)告基因的表達(dá)。結(jié)果證明PPARγ是miR-27a的靶點(diǎn)。PPARγ WT+miR-NC，PPARγ WT+miR-27a，PPARγ Mut+miR-NC，PPARγ Mut+miR-27a四組的熒光值分別為（5.37±0.80）、（3.17±0.57）、（4.94±0.63）、（4.68±0.74））。見圖4。

圖4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法驗(yàn)證miR-27a的靶點(diǎn)（n＝3）

3 討論

miRNAs是在一類長(zhǎng)約20～24個(gè)核苷酸在進(jìn)化上高度保守的非編碼RNA。miRNAs主要在轉(zhuǎn)錄水平上，通過與目標(biāo)靶基因mRNA 3’-UTR結(jié)合，抑制目標(biāo)靶基因的翻譯或者促進(jìn)目標(biāo)靶基因mRNA的降解，從而抑制目標(biāo)靶基因的功能。到目前為止已發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNA通過各種不同的機(jī)制和途徑調(diào)節(jié)著糖尿病的發(fā)生和胰島素抵抗：如miR-29b可以通過調(diào)控PI3K通路抑制胰島素抵抗［2］。miRNA-93可以通過抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporters 4，GLUT4）表達(dá)從而導(dǎo)致胰島素抵抗［3］，miRNA-145等通過p65轉(zhuǎn)錄因子途徑導(dǎo)致肝細(xì)胞胰島素抵抗等［4］。MiR-27a是一個(gè)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和成熟的miRNA［5］，大量研究表明 miR-27a在糖尿病病人及糖尿病動(dòng)物模型中表達(dá)上調(diào)［6-11］，作者前期研究結(jié)果也表明miR-27a參與了脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗，但是其作用機(jī)制卻并不清楚［1］。進(jìn)一步了解miR-27a在糖尿病的發(fā)病機(jī)制及胰島素抵抗中的作用將為糖尿病的檢測(cè)和治療提供新的手段。

胰島素和胰島素受體結(jié)合后通過活化IRS1，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，從而促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用。胰島素抵抗的產(chǎn)生主要是胰島素信號(hào)通路中的信號(hào)傳導(dǎo)受阻所致。我們檢測(cè)了miR-27a對(duì)胰島素信號(hào)通路的影響，結(jié)果顯示miR-27a抑制了胰島素信號(hào)通路中IRS1、Akt、GSK-3β的磷酸化，提示miR-27a通過抑制胰島素信號(hào)通路促進(jìn)了胰島素抵抗。

然而，miR-27a的具體靶點(diǎn)并不清楚，生物信息學(xué)分析結(jié)果提示IRS1及GSK-3β的3’-UTR存在miR-27a的結(jié)合位點(diǎn)，提示IRS1及GSK-3β可能為miR-27a的靶標(biāo)，但是我們蛋白質(zhì)印跡法的結(jié)果以及雙熒光素酶報(bào)告基因的結(jié)果（結(jié)果未顯示）并未證明IRS1及GSK-3β是miR-27a的直接靶標(biāo)。PPARγ是參與脂肪細(xì)胞生成、成熟、分化的一類核轉(zhuǎn)錄因子，主要表達(dá)于脂肪組織及免疫系統(tǒng)中。PPARγ在代謝性疾病，特別是糖尿病中起重要作用。PPARγ激動(dòng)劑噻唑烷二酮類藥物已被用來治療糖尿病。已有研究表明miR-27a可以調(diào)節(jié)PPARγ的表達(dá)［12-14］，本研究則通過qPCR及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法進(jìn)一步證實(shí)了PPARγ是miR-27a介導(dǎo)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的直接靶點(diǎn)。

由于一個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，一個(gè)靶基因也可以有多個(gè)miRNAs調(diào)節(jié)。為了了解miR-27a是否還有其它作用靶點(diǎn)，我們還對(duì)文獻(xiàn)［16-18］報(bào)道的miR-27a的靶基因同時(shí)也是調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路的基因進(jìn)行了檢測(cè)。叉頭框蛋白1（Forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要表達(dá)于胰島效應(yīng)細(xì)胞，如脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞中。在胰腺中也僅表達(dá)于β細(xì)胞。FOXO1與糖脂代謝，胰島β細(xì)胞增殖與凋亡以及胰島素抵抗有密切關(guān)系［15］。有研究表明miR-27a可以通過靶向FOXO1從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化［16-18］。然而，在3T3-L1細(xì)胞中，我們并沒有觀察到miR-27a的對(duì)FOXO1靶向作用。同樣，有研究表明mir-27a可以靶向PI3K［19］，然而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也并未顯示miR-27a直接調(diào)節(jié)PI3K的表達(dá)。是否還有其它的作用靶點(diǎn)，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，在作者前期研究中發(fā)現(xiàn)miR-27a可介導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，然而機(jī)制并不十分清楚。在本研究中，進(jìn)一步證實(shí)miR-27a可通過抑制胰島素信號(hào)通路、靶向PPARγ的表達(dá)進(jìn)而介導(dǎo)胰島素抵抗。而miR-27a對(duì)PPARγ的下游信號(hào)通路的影響以及炎癥信號(hào)通路的影響將進(jìn)一步明確miR-27a的作用機(jī)制。