宋麗麗,張玲艷,賈偉娟,白志恒,劉 媛,陳云嬌，王學(xué)理

(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028042)

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)屬芽孢桿菌科，蠟樣芽孢桿菌屬，該菌與蘇云金芽孢桿菌及炭疽桿菌等細(xì)菌的生物學(xué)特性相近，為一種較為常見(jiàn)的食源性條件致病菌。部分蠟樣芽孢桿菌可作為促植物生長(zhǎng)劑及動(dòng)物飼料內(nèi)的微生物添加劑。該菌廣泛存在于自然界內(nèi)，在土壤、污水及一些食物表面均可被分離到。此菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，可產(chǎn)生芽孢，兼性厭氧生存。其芽孢熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，是該菌引起食源性食物中毒的一個(gè)較為重要的因子[1]。該菌可引起人和動(dòng)物產(chǎn)生嘔吐、腹瀉等臨床癥狀。近年來(lái)，中國(guó)養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展，通遼地區(qū)更是有著中國(guó)肉牛之都的稱號(hào)。本研究從通遼市某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)病死牛體內(nèi)分離到1株細(xì)菌，對(duì)該菌進(jìn)行分離鑒定，以期對(duì)通遼地區(qū)蠟樣芽孢桿菌的流行病學(xué)調(diào)查及該病的綜合防控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

氯化鈉、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、葡萄糖等購(gòu)自北京化工廠；酵母浸粉與蛋白胨由奧博星公司提供；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、DL2000 DNA marker、PCR mastermix等均購(gòu)自TaKaRa公司；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)ZF-258；藥敏紙片購(gòu)自賽莫爾公司；生化分析使用BD PhoenixTM100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 用接種環(huán)無(wú)菌采集病死牛的心、肝、脾、肺、腎等病變臟器組織，于LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。12 h后可見(jiàn)脾臟組織接種的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出多個(gè)單菌落。挑取菌落革蘭氏染色后鏡檢，并對(duì)單菌落進(jìn)行分離、純化、增菌培養(yǎng)，保存，備用[2]。

1.2.2 分離菌的生化鑒定 使用BD PhoenixTM100全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對(duì)分離菌進(jìn)行生化特性檢測(cè)。吸取25 μL 0.6個(gè)麥?zhǔn)蠁挝坏木褐糜贏ST肉湯培養(yǎng)基內(nèi)混勻，將混合液加到革蘭氏陽(yáng)性菌鑒定檢測(cè)板內(nèi)。將檢測(cè)板放入機(jī)器內(nèi)，24 h后查看檢測(cè)結(jié)果。

1.2.3 分離菌藥敏檢測(cè) 采用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)分離菌對(duì)30種藥物的敏感性[3]。吸取經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)的菌液50 μL于普通瓊脂培養(yǎng)基上，使用涂布器將菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面。將藥敏片貼于涂布菌液的培養(yǎng)基上，之后將此培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)，次日查看試驗(yàn)結(jié)果[4]。

1.2.4 分離菌16S rDNA鑒定 使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌的基因組DNA。參照文獻(xiàn)[5]合成細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增引物，引物序列為上游引物F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物R:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，目的片段大小為1 500 bp。PCR反應(yīng)體系為(20 μL)：2×Det PCR MasterMix 10 μL，模板DNA 1.0 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件： 95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火 1 min，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用10 g/L瓊脂糖膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將擴(kuò)增所獲目的條帶使用DNA凝膠回收試劑盒純化回收并送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST，選取BLAST結(jié)果內(nèi)分離自不同地區(qū)的蠟樣芽孢桿菌(美國(guó)NR074540、朝鮮CP020383、湖南JX294967、美國(guó)AY138272、巴西CP008712、四川KU986648、四川KJ720022、湖北GQ381283、拉巴特JN208091、山西KX905299)及致病性蠟樣芽孢桿菌代表菌株(AF290547)通過(guò)DNAstar軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行核酸同源性比對(duì)。

1.2.5 分離菌動(dòng)物致病性檢測(cè) 選取15只體質(zhì)量為25～30 g的小鼠隨機(jī)分為3組，分別腹腔注射0.5 mL 106CUF/mL分離菌、108CUF/mL分離菌和生理鹽水。注射后每隔1 h觀察并記錄小鼠臨床狀態(tài)。

1.2.6 分離菌毒力基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[6-7]，合成蠟樣芽孢桿菌各毒素基因及看家基因的引物(表1)。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性1 min，退火1 min(溫度見(jiàn)表1)，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

表1 蠟樣芽孢桿菌毒力基因引物Table 1 Virulence gene primers of Bacillus cereus

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特性

病牛臟器組織劃線的平板培養(yǎng)12 h后，僅脾臟組織劃線的平板上有菌落生長(zhǎng)，均為灰白色、不透明的小菌落，挑起時(shí)呈絲狀。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后可見(jiàn)菌落邊緣向外擴(kuò)展，整體呈蠟滴狀。挑取單菌落染色鏡檢，均為兩端鈍圓，多呈單個(gè)或鏈狀排列的革蘭氏陽(yáng)性桿菌(圖1)。

2.2 分離菌生化鑒定

生化結(jié)果顯示，該菌株能分解葡萄糖、麥芽糖、果糖等，不能分解尿素、D-塔格糖、β-龍膽二糖等(表2)。全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)提示該菌為蠟樣芽孢桿菌。

2.3 分離菌藥敏檢測(cè)

對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行記錄并分析(表3)。結(jié)果顯示，該菌對(duì)頭孢氨芐、頭孢唑啉、慶大霉素、諾氟沙星等藥物敏感，對(duì)頭孢哌酮、四環(huán)素、多粘菌素B等藥物中度敏感，對(duì)青霉素、新霉素、克林霉素等藥物耐藥。

2.4 分離菌16S rDNA檢測(cè)及其進(jìn)化樹(shù)分析

由細(xì)菌16S rDNA PCR電泳結(jié)果可見(jiàn)，樣品孔出現(xiàn)與目的基因大小相符的1 500 bp條帶(圖2)。測(cè)序結(jié)果顯示該片段大小為1 492 bp，為蠟樣芽孢桿菌的16S rDNA片段。將所分離細(xì)菌菌株命名為TL株，根據(jù)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果(圖3)可知，TL與山西分離株Kx905299親源關(guān)系最近，同源性為99.8%。與其他參考毒株親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

圖1 分離菌株在顯微鏡下的形態(tài)(1 000×)Fig.1 Morphology of isolates under microscope (1 000×)

表2 分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Biochemical test results of isolated strains

注：+.陽(yáng)性；-.陰性。

Note: +.Positive;-.Negative.

表3 分離菌藥物敏感性試驗(yàn)Table 3 Drug sensitivity test of isolates

注：R.耐藥；I.中度敏感；S.敏感。

Note:R.Drug resistance;I.moderate resistance;S.sensitive.

M.DL2000 DNA marker；16S.16S rDNA

2.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

小鼠注射菌液6 h后，106CUF/mL組小鼠出現(xiàn)食欲廢絕、精神萎靡現(xiàn)象，108CUF/mL組小鼠死亡1只，2只出現(xiàn)呼吸急促，倒地不起，其余小鼠精神萎靡。注射12 h后， 106CUF/mL組小鼠死亡2只，108CUF/mL組小鼠死亡4只，24 h后兩個(gè)試驗(yàn)組的小鼠全部死亡。整個(gè)試驗(yàn)期對(duì)照組小鼠無(wú)異常。采集死亡小鼠臟器組織進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，從心臟組織中分離到該菌。表明該分離菌具有較強(qiáng)的致病性。

2.6 細(xì)菌毒力基因PCR鑒定

對(duì)所分離蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行毒力基因PCR鑒定，經(jīng)10 g/L瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4。樣品孔1、2、4、5、6、8、9和11分別擴(kuò)增出與hblA、hblC、groEL、nheB、nheC、hblD、nheA、entFM基因片段大小相同且清晰可見(jiàn)的條帶，多次試驗(yàn)未檢測(cè)到bceT、cytK、ces基因。由此可知，此蠟樣芽孢桿菌分離株含有看家基因groEL，溶血性腸毒素毒力基因hblA、hblC、hblD，非溶血性腸毒素毒力基因nheA、nheB、nheC以及腸毒素毒力基因entFM，不含有腸毒素毒力基因bceT、細(xì)胞毒素毒力基因cytK及嘔吐毒素毒力基因ces。

圖3 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene

M.DL2000 DNAMarker；16S.16S rDNA；1.hblA；2.hblC；3.ces；4.groEL；5.nheB；6.nheC；7.cytK；8.hblD；9.nheA；10.bceT； 11.entFM

圖4 分離菌16S rDNA及毒力基因擴(kuò)增結(jié)果
Fig.4 Results of 16S rDNA and virulence gene amplification of isolated bacteria

3 討 論

蠟樣芽孢桿菌分為無(wú)毒菌株和有毒菌株。無(wú)毒菌株作為益生菌，在進(jìn)入動(dòng)物腸道后，可影響腸道免疫細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子的分泌，并且可產(chǎn)生桿菌肽等抗菌物質(zhì)來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力[8]。此外，該細(xì)菌在降低動(dòng)物腹瀉率、提高動(dòng)物采食量、促進(jìn)反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)容物代謝等方面均有良好的效果[9]。另外，無(wú)毒菌株作為益生菌在種植業(yè)及魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)等方面應(yīng)用也十分廣泛。焦文沁等[10]研究表明，蠟樣芽孢桿菌對(duì)小麥有明顯防病、促生長(zhǎng)、提高抗逆性的作用。張洪玉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，給蝦拌餌投喂蠟樣芽孢桿菌可顯著促進(jìn)蝦的生長(zhǎng)，并提高其機(jī)體免疫力。

有毒蠟樣芽孢桿菌為一種常見(jiàn)的食源性條件致病菌，可引發(fā)人或動(dòng)物的食物中毒，臨床多見(jiàn)患者產(chǎn)生腹瀉或嘔吐癥狀，這是由于該菌可產(chǎn)生嘔吐型腸毒素與腹瀉型腸毒素。嘔吐毒素Cereulide由ces基因控制合成[12]。腹瀉型毒素主要包括溶血型腸毒素HBL(Hemolysin BL)、非溶血型腸毒素Nhe(Nonhemolytic enterotoxin)、細(xì)胞毒素CytK(Cytotoxin)、腸毒素T(BceT)、和腸毒素FM(EntFM)。其中HBL通常會(huì)由hblA、hblB、hblC、hblD4個(gè)基因構(gòu)成，但有些菌體hblB會(huì)有缺失，nhe由nheA、nheB、nheC 3種毒力亞基組成，其余3種毒素為單一基因產(chǎn)物。溶血性腸毒素hbl與細(xì)菌的細(xì)胞毒性及其與細(xì)胞作用過(guò)程中孔隙的形成有關(guān)[13]。非溶血性腸毒素基因nhe合成的蛋白可引發(fā)中毒，細(xì)胞毒素K為穿孔毒素，可致細(xì)胞發(fā)生死亡。嘔吐毒素為一種環(huán)形小分子肽，可引發(fā)伴有嘔吐癥狀的食物中毒。有研究表明nhe基因、entFM基因、bceT基因?yàn)橄灅友挎邨U菌的主要毒力基因，這些毒力基因所編碼的毒素也被認(rèn)為是蠟樣芽孢桿菌的主要毒力蛋白[14]。本試驗(yàn)對(duì)分離菌所含毒素基因進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示該菌含有溶血性腸毒素基因hbl、非溶血性腸毒素基因nhe及腸毒素基因entFM。因此可以推測(cè)該分離菌株的致病性可能與所檢測(cè)到的毒力基因所編碼的毒素有關(guān)。

近年來(lái)隨著抗生素等藥物的濫用和亂用，該菌的侵襲力也在不斷發(fā)生變化。Veysseyre 等[15]對(duì)一所醫(yī)院5 a內(nèi)確診為感染蠟樣芽孢桿菌患者的臨床癥狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示29.8%的患者發(fā)生單純菌血癥，28.1%的患者發(fā)生皮膚感染， 17.5%的患者發(fā)生骨及關(guān)節(jié)感染，11.8%的患者發(fā)生死亡，54.4%的患者在內(nèi)科進(jìn)行治療。該細(xì)菌的靶器官?gòu)淖畛醯奈改c道擴(kuò)展到其他臟器，甚至可使宿主死亡，可見(jiàn)蠟樣芽孢桿菌的侵染能力逐漸變強(qiáng)。蠟樣芽孢桿菌不僅對(duì)人類的侵染性發(fā)生變化，其對(duì)動(dòng)物的侵襲力也在逐步增強(qiáng)。

崔一龍等[16]從馬皮下膿腫內(nèi)分離到致病性蠟樣芽孢桿菌，趙振宇等[5]從仔豬的肝臟內(nèi)分離到新型致病性蠟樣芽孢桿菌，二者均以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行細(xì)菌的動(dòng)物致病性試驗(yàn)，結(jié)果顯示兩菌株均具有較強(qiáng)的致病性，可使小鼠發(fā)生死亡。蠟樣芽孢桿菌對(duì)牛的致病性主要表現(xiàn)為奶牛乳房炎，而本次所分離的菌株導(dǎo)致牛發(fā)生猝死，蠟樣芽孢桿菌對(duì)?？蓪?dǎo)致猝死迄今未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。核苷酸同源性結(jié)果表明，TL株與人源致病菌株Af290547、豬源致病菌株Jx294967的同源性分別為99.6%和99.5%。與參考菌株序列堿基對(duì)比結(jié)果可見(jiàn)，TL菌株16S rDNA的第265位堿基由T轉(zhuǎn)變?yōu)镃，而這一不同之處是否與菌株間致病性差異有關(guān)還需進(jìn)行近一步研究。

目前，蠟樣芽孢桿菌感染動(dòng)物的情況逐漸增多，在通遼地區(qū)已出現(xiàn)多起牛感染蠟樣芽孢桿菌致死案例。