顧 欣，劉文輝，楊環(huán)羽，柳強(qiáng)娟，孫 權(quán)，王 銳，王新譜

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

有機(jī)磷農(nóng)藥(Organophosphorus pesticide,OP)是應(yīng)用最廣的一類(lèi)有機(jī)農(nóng)藥[1]，其毒性給人類(lèi)、其他生物和環(huán)境帶來(lái)一系列問(wèn)題[2]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的OP大部分進(jìn)入耕作環(huán)境，其中土壤是農(nóng)藥殘留累積的主要場(chǎng)所。由于農(nóng)藥自身物理化學(xué)性質(zhì)、使用頻次和土壤環(huán)境的差異，不同OP的自然降解過(guò)程長(zhǎng)短不一，從數(shù)天到數(shù)百天[3-4]。為了避免土壤農(nóng)藥殘留過(guò)量累積對(duì)人類(lèi)和環(huán)境造成更大的危害，研究OP的加速降解技術(shù)迫在 眉睫。

目前，OP的降解主要有微生物降解、光降解和氧化降解3個(gè)途徑[5]。其中，微生物降解方法以其環(huán)境友好、無(wú)二次污染、使用便捷等優(yōu)點(diǎn)而獲得人類(lèi)的青睞。因此，具有OP降解功能的微生物研究成為熱點(diǎn)。目前，已知多種OP降解菌，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)等微生物，都是針對(duì)某種單一OP進(jìn)行定向篩選分離獲得的[6-8]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，由于耕作方式和環(huán)境變化導(dǎo)致不同害蟲(chóng)在同一田塊中發(fā)生，造成不同種類(lèi)的OP同時(shí)或先后被施用并累積于土壤。因此，篩選對(duì)多種OP都具有降解能力的廣譜降解菌，有利于提高農(nóng)田土壤修復(fù)效率，同時(shí)降低修復(fù)成本。部分學(xué)者在這方面開(kāi)展了研究，如Pino等[9]通過(guò)選擇富集法，從農(nóng)藥污染土壤中獲得對(duì)毒死蜱和甲基對(duì)硫磷都具有較好降解效果的菌系。某些真菌，如淡紫青霉(Penicilliumlilacinum)BP303菌株產(chǎn)生的酶可以使OP的P-O和PS鍵發(fā)生裂解，從而具有同時(shí)降解對(duì)氧磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷的功能，其中對(duì)氧磷是該菌株的優(yōu)選底物[10]。3株蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)對(duì)毒死蜱、甲基對(duì)硫磷和三唑磷具有不同的降解能力[11]。1株施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)對(duì)甲基對(duì)硫磷具有較高降解率，對(duì)氧化樂(lè)果、甲拌磷和辛硫磷也具有一定降解效果[12]。

本研究選擇毒死蜱、氧化樂(lè)果和水胺硫磷作為目標(biāo)降解物，開(kāi)展OP廣譜降解菌的分離篩選和初步鑒定，確定其對(duì)不同種類(lèi)農(nóng)藥的降解效果及其降解功能的遺傳穩(wěn)定性，為OP高效降解菌的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和研究提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

用于OP降解菌富集、篩選的土壤樣品采集自銀川市軍馬場(chǎng)農(nóng)田、銀川市區(qū)周邊農(nóng)田、賀蘭縣菜田和果園，都曾經(jīng)施用過(guò)毒死蜱、氧化樂(lè)果或水胺硫磷。取表層土5～20 cm，剔除其中的石塊、植株殘?bào)w，陰涼處攤開(kāi)自然風(fēng)干，過(guò)2.0 mm篩，備用。

非耕作土壤采集自銀川市軍馬場(chǎng)荒地，經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，用于OP加標(biāo)回收試驗(yàn)及盆栽試驗(yàn)。該土壤樣品質(zhì)地為砂壤，酸堿度為8.57，全鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.60 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.87 g·kg-1，堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.05 g·kg-1，速效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.32 g·kg-1，速效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為203.39 g·kg-1。

1.2 有機(jī)磷農(nóng)藥

購(gòu)自銀川市農(nóng)資市場(chǎng)，基本情況見(jiàn)表1。

表1 有機(jī)磷農(nóng)藥基本情況Table 1 Organophosphorus pesticides

1.3 主要培養(yǎng)基和試劑

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.4，用于菌種活化。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中加瓊脂15.0～20.0 g·L-1，用于菌種保存、活化和傳代培養(yǎng)。

固體選擇培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，冷卻至約40 ℃加入試驗(yàn)用OP(毒死蜱、氧化樂(lè)果或水胺硫磷，下同)，使OP終質(zhì)量濃度為1 g·L-1，用于降解菌的初篩和 純化。

液體選擇培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，冷卻至約40 ℃加入試驗(yàn)用OP，使OP終質(zhì)量濃度為1 g·L-1，用于降解菌的復(fù)篩。

淀粉瓊脂培養(yǎng)基，用于淀粉水解試驗(yàn)。葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，用于葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)。葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)液，用于乙酰甲基甲醇(V-P)試驗(yàn)。葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，用于甲基紅試驗(yàn)。檸檬酸鐵銨培養(yǎng)基，用于硫化氫試驗(yàn)。硝酸鹽培養(yǎng)基，用于硝酸鹽還原試驗(yàn)。營(yíng)養(yǎng)明膠培養(yǎng)基，用于明膠液化試驗(yàn)。尿素培養(yǎng)基，用于脲酶試驗(yàn)。蛋白胨水培養(yǎng)基，用于吲哚試驗(yàn)。苯丙氨酸脫羧酶培養(yǎng)基，用于苯丙氨酸脫羧酶試驗(yàn)[13]。

主要試劑與標(biāo)準(zhǔn)品：二氯甲烷(分析純)，石油醚(分析純)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒和DNA片段快速回收純化試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。其余試劑均為標(biāo)準(zhǔn)品，為毒死蜱、氧化樂(lè)果(純度99%)和水胺硫磷(純度98%)，購(gòu)自寧夏恒元?jiǎng)?chuàng)科貿(mào)有限公司。

1.4 降解菌的富集與分離純化

采用不同的OP液體選擇培養(yǎng)基，加入質(zhì)量比為1∶100的土壤樣品，于30 ℃、200 r·min-1恒溫避光振蕩培養(yǎng)6 d。將培養(yǎng)液以φ=10%接種量轉(zhuǎn)接至新的OP液體選擇培養(yǎng)基中，使其中OP終質(zhì)量濃度逐級(jí)增加，分別為1.5、2.0、2.5、3.0 g·L-1。至培養(yǎng)結(jié)束，取培養(yǎng)液1 mL與 19 mL 50 ℃左右的OP固體選擇培養(yǎng)基混勻，冷卻制平板，于30 ℃恒溫箱避光倒置培養(yǎng)。對(duì)長(zhǎng)出的菌落經(jīng)3次劃線分離純化，獲得純培養(yǎng)菌種，置于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.5 降解菌初篩

采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基于30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)菌種，活化18 h。搖勻后，用無(wú)菌水制備菌懸液，于37 ℃、200 r·min-1振蕩2 h，稀釋后使其中細(xì)菌終數(shù)量密度為0.2×108CFU·mL-1。采用固體平板培養(yǎng)法，在固體選擇培養(yǎng)基表面以輻射對(duì)稱方式放置8個(gè)無(wú)菌牛津杯，每個(gè)杯內(nèi)注入110 μL菌懸液。于37 ℃恒溫避光培養(yǎng)24 h，牛津杯內(nèi)的液體幾乎全部自然蒸發(fā)。取出牛津杯，于原培養(yǎng)條件倒置培養(yǎng)2～4 d，以等量無(wú)菌水為對(duì)照，每處理設(shè)5個(gè)重復(fù)。觀察牛津杯外側(cè)有無(wú)降解圈，以不同角度用游標(biāo)卡尺測(cè)量降解圈外徑3次，取均值作為降解圈外徑。以降解圈外徑大小作為初篩依據(jù)，選擇降解圈最大和較大的菌株進(jìn)入復(fù)篩。

1.6 降解菌復(fù)篩

活化菌種，制備菌懸液，方法同“1.5”。取 1 mL菌懸液接種于99 mL OP液體選擇培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1恒溫避光振蕩培養(yǎng)72 h，檢測(cè)其中OP殘留量。以不接種的液體選擇培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。降解率計(jì)算公式如下：

降解率=(空白對(duì)照OP殘留量-降解菌處理OP殘留量)/空白對(duì)照OP殘留量×100%

比較各菌株對(duì)3種OP的降解率，以降解率較高的菌株作為目標(biāo)菌株。

1.7 降解菌降解能力的遺傳穩(wěn)定性

活化目標(biāo)菌株，方法同“1.5”。進(jìn)行傳代培養(yǎng)，分別測(cè)定初始菌、第5代和第10代對(duì)3種OP的降解率，檢測(cè)方法同“1.6”。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。以降解率較穩(wěn)定的菌株為OP廣譜降解菌株。

1.8 降解菌鑒定

1.8.1 形態(tài)學(xué)鑒定 采用平板劃線法活化目標(biāo)菌株，牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)18 h，形成單一菌落。觀察菌落的形態(tài)、顏色、直徑大小及菌落邊緣是否整齊；經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體形態(tài)，測(cè)量長(zhǎng)短徑，芽孢有無(wú)等。

1.8.2 生理生化鑒定 包括葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)和菌膜形成試驗(yàn)。參照東秀珠《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行分類(lèi)鑒定[13]。

1.8.3 分子鑒定 提取細(xì)菌總DNA[14]。引物為27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。PCR 條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s， 72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸 8 min，16 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)擴(kuò)增效果后在10 g·L-1瓊脂糖凝膠上做電泳分析，回收 16S rDNA，委托廣州賽哲生物技術(shù)公司完成 測(cè)序。

1.8.4 系統(tǒng)發(fā)育地位確定 將測(cè)序獲得的菌株16S rDNA基因序列提交到NCBI總數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)BLAST軟件在線比對(duì)，進(jìn)行同源性分析。選擇同源性關(guān)系比較近的序列，采用MEGA 5.0建立進(jìn)化樹(shù)。

1.9 降解菌對(duì)土壤中OP的降解能力

1.9.1 降解菌菌懸液制備 活化降解菌，方法同“1.5”。用無(wú)菌水制備有效活菌數(shù)量密度為 1.0×108CFU·mL-1的菌懸液。

1.9.2 土壤中OP降解試驗(yàn) 于避光處，在預(yù)處理后的非耕作土壤中，用小型噴霧器添加3種OP，邊噴邊攪拌，充分混勻，使土壤中3種OP原藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到1.0 mg·kg-1干土，制成試驗(yàn)用污染土。用同樣方法噴入菌懸液，攪拌均勻，使降解菌在試驗(yàn)土壤中的初始數(shù)量密度為0.2×108CFU·g-1干土。立即將混勻后的土壤裝花盆?；ㄅ枭?、下口直徑分別為16.0 cm和11.0 cm，高14.0 cm，裝土量為1.0 kg。用無(wú)菌水調(diào)節(jié)土壤濕度為20%。置于溫室，正常光照，每日根據(jù)蒸發(fā)量補(bǔ)水。以不添加降解菌的OP污染土為對(duì)照。每處理3個(gè)重復(fù)。分別于裝盆后的0(裝盆后4 h)、1、3、5、7、14、21 d取0 ～10 cm的土樣，每處理采用多點(diǎn)混合，四分法取樣，用密封袋裝好，放入有冰袋的保溫箱內(nèi)，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行OP質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)。

1.10 菌液數(shù)量密度及土壤理化性質(zhì)檢測(cè)

菌液數(shù)量密度：采用梯度稀釋平板培養(yǎng)法。用無(wú)菌生理鹽水制備菌液的梯度稀釋液，分別取1 mL稀釋液倒入50～60 ℃、15 mL牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，立即混勻，靜置冷卻，37 ℃倒置培養(yǎng) 24 h，菌落計(jì)數(shù)。每個(gè)數(shù)量密度梯度3個(gè)重復(fù)，計(jì)算菌液的活菌數(shù)量密度。

土壤的理化性質(zhì)：采用烘干法測(cè)含水量；采用電位法測(cè)pH；采用重鉻酸鉀容量法測(cè)有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)[15]。

1.11 樣品中OP殘留量的檢測(cè)

1.11.1 OP殘留量的檢測(cè) 參照NY/T 761-2008中OP農(nóng)藥殘留的提取方法處理培養(yǎng)液樣品[16]；參照Fang等[17]的方法處理土壤樣品。采用氣相色譜分析法。儀器條件為Agilent 7980A-ECD；色譜柱為HP-5石英毛細(xì)柱，30 m×0.32 mm×0.25 μm；毒死蜱、氧化樂(lè)果檢測(cè)時(shí)的進(jìn)樣口溫度220 ℃，檢測(cè)器溫度320 ℃，柱溫270 ℃；水胺硫磷檢測(cè)時(shí)的進(jìn)樣口溫度220 ℃，檢測(cè)器溫度200 ℃，柱溫170 ℃；載氣均為高純氮?dú)?純度99.999%)，流速為1.0 mL·min-1。采用不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL。用外標(biāo)法計(jì)算樣品中OP的殘留量。

1.11.2 土壤中OP加標(biāo)回收試驗(yàn) 取預(yù)處理后的非耕作土壤樣品，避光稱取3種OP標(biāo)品分別與之混勻，制成OP初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1、 0.5、1.0、5.0 mg·kg-1干土的含農(nóng)藥土壤，以不加OP為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。按照“1.11.1”的方法檢測(cè)土壤中OP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別計(jì)算3種OP的加標(biāo)回收率。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖；采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，在P<0.05水平上進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。采用MEGA 5.0建立進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌初篩

初篩共獲得菌株12株，見(jiàn)表2。各菌株在不同培養(yǎng)基上形成的降解圈外徑不同。牛津杯內(nèi)徑為6 mm，降解圈外徑越大，說(shuō)明該菌株在相應(yīng)OP選擇培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況越好。因此，依據(jù)降解圈外徑的大小可以對(duì)各菌株的農(nóng)藥降解性能進(jìn)行初步比較。試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)是選擇對(duì)3種OP都具有一定降解能力的菌株，故選擇3種OP培養(yǎng)基上都具有降解圈，且降解圈外徑最大和較大的菌株作為目標(biāo)菌株。在毒死蜱、氧化樂(lè)果和水胺硫磷固體選擇培養(yǎng)基上的降解圈外徑最大的菌株編號(hào)分別為A1A18、A5C2和B2C6，且3個(gè)菌株對(duì)3種OP均有一定的降解能力，說(shuō)明不同菌株對(duì)不同農(nóng)藥的降解性能具有差異，以這3個(gè)菌株作為目標(biāo)菌株進(jìn)入復(fù)篩。

表2 初篩菌株的來(lái)源土壤及其在3種OP選擇培養(yǎng)基上的降解圈外徑Table 2 Source soil and outer diameter of degradation circle of strains in three kinds of OP selection media in preliminary screening mm

注：不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letters represent significant difference (P<0.05),the same below.

2.2 降解菌復(fù)篩

將初篩獲得的3個(gè)菌株在毒死蜱、氧化樂(lè)果和水胺硫磷液體選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，檢測(cè)各菌株在液體環(huán)境中對(duì)農(nóng)藥的降解率，結(jié)果如圖1。3個(gè)菌株對(duì)3種OP都有一定降解能力，但降解效果具有差異。比較毒死蜱的降解率，3個(gè)菌株由高到低是A1A18、A5C2、B2C6，A1A18的降解率最高，為45.82%。比較氧化樂(lè)果的降解率，3個(gè)菌株由高到低是A5C2、A1A18、B2C6，A5C2和A1A18的降解率分別為9.90%和9.52%，其差異未達(dá)顯著水平。比較水胺硫磷的降解率，3個(gè)菌株由高到低是B2C6、A1A18、A5C2，B2C6的降解率最高，為24.64%，A5C2對(duì)水胺硫磷的降解能力很低。由此可知，在3株細(xì)菌中菌株A1A18對(duì)3種OP均具有一定的降解能力，降解率分別為45.82%、9.52%和13.96%。以菌株A1A18作為目標(biāo)菌株，開(kāi)展降解能力遺傳穩(wěn)定性研究。

圖1 液體培養(yǎng)條件下目標(biāo)菌株對(duì)3種OP的降解率Fig.1 Degradation rate of three kinds of OP by 3 strains in liquid fermentation

2.3 A1A18菌株降解能力的遺傳穩(wěn)定性

對(duì)復(fù)篩獲得的目標(biāo)菌株A1A18進(jìn)行傳代培養(yǎng)。該菌株的第1、5、10代對(duì)試驗(yàn)用3種OP的降解率如圖2。菌株A1A18對(duì)毒死蜱和氧化樂(lè)果的降解能力在第5、10代分別較第1代下降 1.90%～3.40%和14.18%～16.18%，但各代之間差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上未達(dá)顯著水平。由此可知，菌株A1A18對(duì)毒死蜱、氧化樂(lè)果和水胺硫磷的降解能力遺傳穩(wěn)定性較好。

圖2 菌株A1A18對(duì)3種OP降解能力的遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Degradation capacity genetic stability of strain A1A18 to five kinds of OP

2.4 A1A18菌株鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 A1A18菌株在瓊脂培養(yǎng)基表面形成菌落。菌落顏色為灰白色，直徑為 0.5～0.8 cm，圓形，表面光滑，不透明，側(cè)面觀似草帽狀，中部具有凸起，邊緣較整齊具有蠟質(zhì)感。菌體為直桿狀，大小為(0.3～0.5) μm×(1.5～ 2.5) μm，具圓端，無(wú)芽孢(圖3)。

圖3 菌株A1A18的菌落形態(tài)(A)和菌體形態(tài)(B)Fig.3 Colony(A) and bacteria(B) morphology of strain A1A18

2.4.2 生理生化鑒定 依據(jù)菌株A1A18的形態(tài)特征及生理生化試驗(yàn)結(jié)果(表3)進(jìn)行鑒定，初步判斷該菌株與短波單胞菌屬(Brevundimonas)細(xì)菌的主要特征一致。

2.4.3 分子鑒定 菌株A1A18的16S rDNA基因序列長(zhǎng)度為1 357 bp，NCBI系統(tǒng)中GenBank登錄號(hào)為MK110476。將該序列錄入NCBI，進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果與短波單胞菌屬(Brevundimonassp.)相應(yīng)基因序列具有99%的同源性。選取該基因庫(kù)中同科近緣的7個(gè)屬典型代表菌種進(jìn)行16S rDNA序列比對(duì)，通過(guò)MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。通過(guò)對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析，可知該菌株為短波單胞菌(Brevundimonassp.)。

2.5 A1A18菌株對(duì)土壤中OP的降解能力

2.5.1 土壤中OP加標(biāo)回收率 毒死蜱、氧化樂(lè)果和水胺硫磷3種OP在土壤樣品中的加標(biāo)回收率見(jiàn)表4?？瞻讓?duì)照中未檢測(cè)出3種OP殘留。毒死蜱、氧化樂(lè)果或水胺硫磷在試驗(yàn)土樣中的平均加標(biāo)回收率分別為91.039%～100.703%、 89.215%～99.762%、87.996%～99.702%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.906%～4.415%、 1.986%～ 3.830%、2.763%～4.718%。表明使用該方法檢測(cè)試驗(yàn)土壤樣品中的毒死蜱、氧化樂(lè)果和水胺硫磷，回收率較高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法對(duì)加標(biāo)回收率70%～110%的要求[18]。

2.5.2 A1A18菌株對(duì)土壤中3種有機(jī)磷農(nóng)藥的降解能力 試驗(yàn)土壤中添加降解菌A1A18，對(duì)土壤中毒死蜱、氧化樂(lè)果和水胺硫磷3種OP的降解均具有促進(jìn)作用(圖5)。

對(duì)添加A1A18菌株處理與未添加降解菌的對(duì)照進(jìn)行比較，隨著試驗(yàn)時(shí)間的增加，土壤中毒死蜱的降解率顯著提高。第3天時(shí)，施菌處理和CK的毒死蜱降解率分別為38.75%和21.97%，增幅為76.39%；第5天的降解率分別為63.02%和38.72%，增幅為62.76%。隨后，二者差異呈縮小的趨勢(shì)，到第21天，毒死蜱降解率分別為88.81%和76.40%，增幅為16.24%。

表3 菌株A1A18的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical identification results of strain A1A18

注：“+” 表示反應(yīng)陽(yáng)性，“-”表示反應(yīng)陰性。

Note: “+” positive reaction,“-” negative reaction.

圖4 基于A1A18菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain A1A18 based on 16S rDNA sequence analysis

OP加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·kg-1) Mass fractionof OP毒死蜱 Chlorpyrifos平均加標(biāo)回收率/%Average recovery of standard addition相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%RSD氧化樂(lè)果 Folimat平均加標(biāo)回收率/%Average recovery of standard addition相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%RSD水胺硫磷 Isocarbophos平均加標(biāo)回收率/%Average recovery of standard addition相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%RSD0.191.0393.01289.2152.74087.9964.7180.594.6421.90698.7092.86190.4593.2911.095.7572.64496.3743.83099.7022.7635.0100.7034.41599.7621.98697.6683.184

在氧化樂(lè)果處理組中，添加A1A18菌株與CK的氧化樂(lè)果降解率進(jìn)行比較，二者在前期均表現(xiàn)出較高的降解率，第1天時(shí)分別為19.21%和11.98%，增幅為60.38%，第3天的降解率分別為58.29%和42.51%，增幅為37.12%，第7天的降解率分別已達(dá)86.19%和76.48%，增幅為12.69%。隨著時(shí)間的增加，兩處理的差異逐漸趨于減少，至第14天，二者的降解率均大于 89.62%，且差異均未達(dá)顯著水平。至第21天，兩處理的降解率達(dá)到94.59%及以上，接近完全降解。

在水胺硫磷處理組中，施菌后顯著提高土壤中農(nóng)藥的降解率。添加A1A18菌株處理的降解率為第1天的11.85%，第7天的51.46%，第21天的87.75%；CK的降解率為第1天的 6.07%，第7天的29.68%，第21天的70.40%。降解率的增幅從95.25%(第1天)逐漸降低至 73.37%(第7天)，進(jìn)而降低至26.64%(第21天)。

圖5 添加降解菌A1A18對(duì)土壤中毒死蜱(A)、氧化樂(lè)果(B)和水胺硫磷(C)降解率的影響Fig.5 Effects of strain A1A18 on degradation rate of chlorpyrifos(A),folimat(B) and isocarbophos(C) in tested soil

3 討 論

本試驗(yàn)所用土壤來(lái)自非耕作地，質(zhì)地為砂壤，具有偏堿性、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低、組成成分較簡(jiǎn)單，3種OP在該土壤中的平均加標(biāo)回收率均滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的要求，表明該試驗(yàn)方法的精確度可用于檢測(cè)試驗(yàn)土壤中3種OP的殘留量。

不同的微生物對(duì)不同種類(lèi)OP的降解機(jī)制具有差異[19-20]。毒死蜱和水胺硫磷具有P=S雙鍵，氧化樂(lè)果具有P=O雙鍵。有的微生物利用有機(jī)磷酸水解酶、磷酸三酯酶等催化斷裂磷硫鍵、磷氧鍵和磷氟鍵[19,21]；有的微生物采用共代謝作用、礦化作用、種間協(xié)同代謝作用等降解OP[22]。研究表明，短波單胞菌屬細(xì)菌具有磷酸三酯酶[23]，對(duì)毒死蜱、樂(lè)果和對(duì)硫磷等多種OP均具有降解作用[24-26]。分子生物學(xué)研究證明，短波單胞菌細(xì)胞有關(guān)OP的水解酶位于細(xì)胞質(zhì)膜的周質(zhì)面，其對(duì)有機(jī)磷的水解機(jī)制涉及雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)通路[27]。本試驗(yàn)菌株為短波單胞菌A1A18，對(duì)毒死蜱、水胺硫磷和氧化樂(lè)果均具有一定的降解能力，由此推測(cè)，該菌株對(duì)3種OP的降解機(jī)制可能與此有關(guān)。

除了生物學(xué)因素，光照強(qiáng)度、時(shí)間，土壤的物理、化學(xué)性質(zhì)，以及OP的自身特性均影響其在土壤中的降解率。毒死蜱、氧化樂(lè)果和水胺硫磷都有光降解現(xiàn)象[28-30]。土壤質(zhì)地砂壤較粘壤、pH呈堿性較酸性或中性更有利于OP的降解[31]，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高有利于OP的吸附[32]。本試驗(yàn)條件為正常溫室光照，土壤為砂壤、堿性、有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，加之土壤中原有土著微生物對(duì)OP具有一定降解作用，因此，土壤試驗(yàn)對(duì)照組中3種OP的降解率都較液體培養(yǎng)試驗(yàn)更高。尤其氧化樂(lè)果，施藥后第14天，無(wú)論是否添加降解菌，降解率都高于89.62%，至第21天時(shí)，幾乎完全降解。這可能是由于氧化樂(lè)果中含有P=O雙鍵，較毒死蜱和水胺硫磷中的P=S雙鍵具有更強(qiáng)的極性，更易發(fā)生斷裂[33]，導(dǎo)致氧化樂(lè)果在堿性環(huán)境中較其他2種OP更易降解。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)短波單胞菌屬細(xì)菌降解OP的研究多涉及單一種類(lèi)的OP，如Brevundimonassp.Dsp-7對(duì)毒死蜱具有一定降解功能[24]；Brevundimonassp.MCM B-427在適宜的pH下對(duì)樂(lè)果具有較好的降解效果[25]；多株B.diminuta具有對(duì)硫磷水解酶，降解能力較強(qiáng)[26]。涉及多種OP底物的該屬降解菌研究較少，如Brevundimonassp.MM1，可以水解苯胺磷、苯胺磷亞砜和苯胺磷砜的P-O-C鍵，對(duì)3種OP具有較好的降解能力[34]。采用該屬中的降解菌株用于毒死蜱、氧化樂(lè)果和水胺硫磷3種OP污染土壤的修復(fù)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。試驗(yàn)結(jié)果表明，施藥后第7天，添加A1A18菌株處理的土壤中氧化樂(lè)果降解率達(dá)86.19%，較CK提高12.69%。施藥后第21天，該菌株處理的土壤中毒死蜱和水胺硫磷的降解率均超過(guò)87.75%，較CK提高16.24%和24.62%；說(shuō)明短波單胞菌A1A18菌株促進(jìn)3種OP的降解，具有較好的田間應(yīng)用潛力。綜上所述，短波單胞菌屬細(xì)菌是具有多種OP降解潛力的微生物，在多種OP底物降解機(jī)制和應(yīng)用開(kāi)發(fā)等諸方面有待開(kāi)展進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

有機(jī)磷農(nóng)藥廣譜降解菌短波單胞菌A1A18菌株對(duì)毒死蜱、氧化樂(lè)果和水胺硫磷具有一定降解能力。在液體培養(yǎng)環(huán)境中，該菌株對(duì)3種有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率分別為45.82%、9.52%和 13.96%。經(jīng)10代培養(yǎng)，確定其農(nóng)藥降解能力具有很好的遺傳穩(wěn)定性。在有機(jī)磷原藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0 mg·kg-1干土的土壤中施用A1A18菌株，降解菌初始數(shù)量密度為0.2×108CFU·g-1干土，施藥后第21天，土壤中毒死蜱和水胺硫磷的降解率分別達(dá)到88.81%和87.75%，較CK提高 16.24%和24.62%；施藥后第7天，土壤中氧化樂(lè)果降解率達(dá)86.19%，較CK提高12.69%。因此，短波單胞菌A1A18作為西北地區(qū)農(nóng)藥污染土壤的修復(fù)菌株具有較好的田間應(yīng)用潛力。