榮朵艷，張 翔，虢雅潔，王菊鳳，潘 婷，楊 港，張邦躍

(1.湖南工業(yè)大學 生命科學與化學學院，湖南株洲 412007；2.百合種質資源創(chuàng)新與深加工湖南省工程研究中心，湖南株洲 412007；3.生物醫(yī)用納米材料與器件湖南省重點實驗室，湖南株洲 412007)

紅花檵木(Loropetalumchinensevar.rubrum)為金縷梅科、檵木屬檵木的變種，是具中國特色的觀花觀葉植物，其花、葉中均可合成花青苷物質而顯紅色。紅花檵木易于繁殖、耐修剪，同時具有較強的適應性和抗逆性，是中國南方很多省園林綠化常用的彩葉植物之一[1]。紅花檵木的紅色葉片具有較高的觀賞價值，但中國南方地區(qū)夏季持續(xù)高溫會導致其葉片顏色由紅變綠，觀賞價值嚴重降低[2]。目前，對紅花檵木葉色變化的機制開展了一些研究，高溫會引起紅花檵木葉片花青苷物質含量的下降，高溫和強光照或者高溫和高濕度協(xié)同作用的脅迫條件會加快花青苷的消失，而輕度干旱有利于花青苷物質的穩(wěn)定[2-5]。然而，對于紅花檵木中花青苷物質合成的分子機制目前還不清楚，花青苷合成途徑基因目前只有LcCHS基因得到克隆[6]。因此，開展紅花檵木花青苷形成分子機制的研究，對于紅花檵木的葉色育種有重要的意義。

花青苷物質是植物產(chǎn)生的一類重要的類黃酮物質，其生物合成過程起始于苯丙氨酸途徑，有多種酶類參與催化過程，其中查爾酮異構酶(Chalcone isomerase，CHI)直接催化查爾酮形成二氫黃酮，是花青苷物質合成途徑的第2個限速酶，對于包括花青苷在內(nèi)的多種類黃酮物質的積累都有重要作用。目前，查爾酮異構酶基因在許多觀賞植物中已經(jīng)被克隆，包括矮牽牛、彩葉草、紫丁香、紅掌、康乃馨等觀賞植物[7-11]。

為了探究紅花檵木葉片花青苷形成的分子機制，作者利用轉錄組測序數(shù)據(jù)和RT-PCR技術，從紅花檵木中克隆到LcCHI的cDNA序列，獲得基因的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，利用生物信息學的方法對LcCHI基因編碼的氨基酸同源性以及結構和功能進行分析，并采用實時熒光定量PCR技術對該基因在不同組織材料中的表達進行分析。同時構建pLcCHI-SUPER1300過表達載體，并在擬南芥中異源表達，獲得轉基因植株，這為進一步對該基因在紅花檵木花青苷生物合成中的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 試材為生長健壯的3 a生紅花檵木扦插苗，于湖南工業(yè)大學校區(qū)苗圃中栽培。采集植株成熟葉或嫩葉，用液氮速凍， -80 ℃冰箱中保存，備用。于2019年3月下旬取得用于實時熒光定量PCR分析的不同組織材料(包括根、莖、成熟葉、嫩葉和花)。其中，根為新生的紅色嫩根，莖和嫩葉均為春季新抽材料，成熟葉為2018年秋末抽出的葉片，花取披針形花瓣。擬南芥野生型材料哥倫比亞-0生態(tài)型(Columbia-0，Col-0)種植于營養(yǎng)土(腐殖土∶蛭石∶珍珠巖= 3∶1∶1)中，置于光照培養(yǎng)箱中生長，生長條件為：16 h光照，8 h黑暗，濕度為70%。

1.1.2 主要試劑 多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒購于北京艾德萊生物科技有限公司。Super M-MuLV逆轉錄酶、RNase Inhibitor、DH5α感受態(tài)、質粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、PCR MIX、限制性內(nèi)切酶等購于生工生物工程上海有限公司。PrimeSTAR GXL高保真DNA聚合酶購于寶日醫(yī)生物技術有限公司。FastStart Essential DNA Green Master試劑購自羅氏應用科學部。無縫連接試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司。農(nóng)桿菌AGL0和過表達質粒pSUPER1300為生物醫(yī)用納米材料與器件湖南省重點實驗室保存。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。引物合成及測序工作均由華大基因完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第1鏈的合成 使用RNA提取試劑盒，提取紅花檵木葉片的RNA，并用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。利用Super M-MuLV逆轉錄酶合成 cDNA第1鏈，反應體系為20.0 μL：先加入8.0 μL RNA和1.0 μL Oligo (dT)18引物，再加入4.0 μL 5×RT 緩沖液、4.0 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L)、0.5 μL RNase Inhibitor和1.0 μL Super M-MuLV，最后用DEPC處理水加至20.0 μL。反應條件為：42 ℃ 50 min，65 ℃ 15 min，產(chǎn)物用于進一步的PCR擴增。

1.2.2 紅花檵木LcCHI基因的克隆 利用已經(jīng)完成的紅花檵木轉錄組測序結果，從中篩選到1個CHI同源基因。經(jīng)分析紅花檵木LcCHI的cDNA序列中包含有完整的開放閱讀框ORF，設計ORF上、下游區(qū)域特異引物CHI-LP和CHI-RP(表1)，以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系為25.0 μL：2×PCR MIX 12.5 μL，上、下游引物各0.7 μL，cDNA 模板0.3 μL，ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)反應； 72 ℃ 2 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測正確后直接送測序(測序引物為CHI-LP和CHI-RP)，以確定CHI的cDNA序列及編碼框序列。

1.2.3 紅花檵木LcCHI氨基酸同源性分析及功能預測 使用DNAMAN 6.0軟件對LcCHI的cDNA序列進行分析，預測該基因編碼的氨基酸序列；利用NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)的BLASTP對該基因編碼的氨基酸同源序列進行搜索，并下載同源性氨基酸序列。利用DNAMAN 6.0軟件對氨基酸序列進行多重比對，利用MEGA 6軟件和非加權組平均法(UPGMA)構建系統(tǒng)進化樹；使用NCBI網(wǎng)站的在線軟件CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對LcCHI基因編碼氨基酸的保守結構域進行分析；利用在線軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel. expasy.org/)對LcCHI蛋白的三級結構進行預測。

1.2.5 紅花檵木LcCHI過表達載體構建及轉化擬南芥 根據(jù)LcCHI的cDNA片段測序結果，確定了LcCHI基因的ORF完整序列。利用Primer premier 5.0軟件設計能夠擴增出紅花檵木LcCHI基因的ORF引物CHI-ATG和CHI-TAG，以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系為25.0 μL：5×GXL buffer 5.0 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol each) 2.0 μL，上、下游引物各0.7 μL，cDNA模板0.3 μL，PrimeSTAR GXL DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序為：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 1 min，共35個循環(huán)反應。PCR擴增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物膠回收后用無縫克隆酶連接到過表達載體pSUPER1300上，轉化DH5α感受態(tài)，陽性菌經(jīng)PCR鑒定后送測序鑒定。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

注：小寫堿基為表達載體末端同源序列，用于構建重組載體；大寫堿基為基因特異引物序列。

Note:Lower-case indicates bases homologous to vector ends in order to make the recombinant vector；upper-case means gene specific primers.

提取大腸桿菌陽性菌的pLcCHI-SUPER1300重組質粒，轉化到農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL0中，并利用農(nóng)桿菌介導的花序侵染法轉化擬南芥。轉基因種子在潮霉素質量濃度為25 mg/L的MS培養(yǎng)基上進行篩選，陽性苗轉移到營養(yǎng)土中繼續(xù)生長。待轉基因植株生長5周后剪取蓮座葉，分別用TRIzon法和SDS法提取葉片的RNA和DNA，RNA進一步反轉錄成第1鏈cDNA。分別以轉基因植株的cDNA和DNA為模板，用ORF特異引物CHI-ATG和CHI-TAG進行轉基因陽性苗的鑒定。半定量RT-PCR檢測LcCHI基因的表達時選擇AtACTIN8為擬南芥的內(nèi)參基因(引物序列見表1)。

2 結果和分析

2.1 紅花檵木LcCHI基因cDNA序列的克隆

利用紅花檵木葉片轉錄組數(shù)據(jù)庫，從中篩選出1個查爾酮異構酶(Chalcone isomerase，CHI)同源基因，命名為LcCHI。對LcCHI序列片段進行分析，發(fā)現(xiàn)該序列片段包含完整的ORF序列。從紅花檵木成熟葉片中提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量(圖1-A)，利用逆轉錄酶合成第1鏈cDNA。設計CHI-LP和CHI-RP引物，以cDNA為模板，擴增出約800 bp的cDNA片段(圖1-B)，該片段包含LcCHI完整ORF序列，PCR產(chǎn)物直接送測序，確定LcCHI的ORF序列。結果表明，紅花檵木LcCHI基因的ORF總長度為657 bp，編碼218個氨基酸殘基(圖2)。

2.2 紅花檵木LcCHI基因編碼的氨基酸序列分析

2.2.1LcCHI多重比對及保守結構域 利用DNAMAN 6.0軟件，對紅花檵木LcCHI和來源于玫瑰RrCHI(AKT71851.1)、月季RcCHI(XP_024176829.1)、茶樹CsCHI(ASU87415.1)、美洲葡萄VlCHI(ACS36662.1)和櫻桃李PcCHI(AKV89240.1)的氨基酸序列進行同源性分析。結果顯示，紅花檵木LcCHI與其他植物CHI氨基酸序列高度保守，氨基酸一致性均超過75%(圖3)。通過與擬南芥AtCHI和紫花苜蓿MsCHI氨基酸序列中催化位點的比對分析[12-13]，發(fā)現(xiàn)5個氨基酸殘基Arg(38)、Thr(46)、Tyr(108)、Asn(115)和Ser(192)執(zhí)行LcCHI酶的催化活性(圖3)。利用NCBI的在線軟件CD-Search對紅花檵木LcCHI進行保守結構域分析，結果表明紅花檵木LcCHI屬于查爾酮_3超家族成員，編碼典型的查爾酮-黃烷酮異構酶(圖4)。

A.總RNA Total RNA；B.CHI-LP和CHI-RP擴增的cDNA片段 cDNA sequence amplificated by using CHI-LP and CHI-RP primer pairs

圖1LcCHI的cDNA序列擴增
Fig.1 Sequence amplification ofLcCHIgene

粗體下劃線分別表示起始密碼子和終止密碼子 Underline in bold indicates initial codon and stop codon respectively

圖2LcCHI的核苷酸及其氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and amino acid sequences ofLcCHIgene

★.酶催化殘基 Enzyme catalytic residues；Lc.紅花檵木Loropetalumchinensevar.rubrum；Rr.玫瑰Rosarugosa；Rc.月季Rosachinensis；Cs.茶樹Camelliasinensis；Vl.美洲葡萄Vitislabrusca；Pc.櫻桃李Prunuscerasifera

圖3 LcCHI多重比對分析
Fig.3 Multiple alignment analysis of LcCHI

圖4 LcCHI保守結構域分析Fig.4 Conserved domain analysis of LcCHI

2.2.2 LcCHI系統(tǒng)進化樹分析 為更加明確紅花檵木LcCHI氨基酸序列與其他植物中CHI氨基酸序列的進化關系，利用MEGA 6軟件對來源于紅花檵木LcCHI、玫瑰RrCHI、月季RcCHI、茶樹CsCHI、美洲葡萄VlCHI、櫻桃李PcCHI、橄欖CaCHI(AEO36936.1)、龍眼DlCHI(AEO36980.1)、美洲葡萄VlCHI(ACS36662.1)、牡丹PsCHI(AEK70330.1)、芍藥PlCHI(AEK32592.1)、煙草NtCHI(NP_001312216.1)、矮牽牛PhCHI(CAA32730.1)、擬南芥AtCHI(CAB94991.1)、水稻OsCHI(AAM13448.1)和玉米ZmCHI(NP_001144002.2)進行系統(tǒng)進化樹構建。結果如圖5所示，紅花檵木LcCHI氨基酸序列與玫瑰、月季和櫻桃李等木本植物的親緣性較近，而與煙草、擬南芥、水稻等草本植物的親緣性較遠。

Rr.玫瑰Rosarugosa；Rc.月季Rosachinensis；Pc.櫻桃李Prunuscerasifera；Lc.紅花檵木Loropetalumchinensevar.rubrum；Ca.橄欖Canariumalbum；Dl.龍眼Dimocarpuslongan；Cs.茶樹Camelliasinensis；Ps.牡丹Paeoniasuffruticosa；Pl.芍藥Paeonialactiflora；Vl.美洲葡萄Vitislabrusca；Nt.煙草Nicotianatabacum；Ph.矮牽牛Petuniaxhybrida；At.擬南芥Arabidopsisthaliana；Os.水稻OryzasativaJaponica Group；Zm.玉米Zeamays

圖5 LcCHI系統(tǒng)進化樹分析
Fig.5 Phylogenetic tree analysis of LcCHI

圖6 LcCHI蛋白的三級結構預測Fig.6 Tertiary structure prediction of LcCHI protein

2.3 LcCHI基因在不同組織中的表達分析

對LcCHI基因在紅花檵木不同組織的表達分析結果表明(圖7)，LcCHI在根、莖、花、成熟葉和嫩葉中均有表達，但表達存在一定的差異性。其中根中表達量最高，嫩葉、莖、花中的表達量次之，成熟葉最低，為根中表達量的1/4。

圖7 不同組織中LcCHI基因的表達分析Fig.7 Relative expression of LcCHI gene in different tissues

2.4 LcCHI過表達載體構建及轉化擬南芥

根據(jù)LcCHI基因的cDNA序列，設計特異引物CHI-ATG和CHI-TAG(表1，上、下游引物均包含約16 bp的載體片段)，用高保真酶GXL擴增，瓊脂糖凝膠電泳正確后膠回收，目的產(chǎn)物連接到已線性化的表達載體上，重組質粒轉化大腸桿菌感受態(tài)，PCR擴增及XbaⅠ+PstⅠ質粒雙酶切鑒定正確后送測序，確定過表達載體pLcCHI-SUPER1300構建成功(圖8)。提取pLcCHI-SUPER1300質粒并轉化到農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL0中，利用農(nóng)桿菌介導的花序侵染法轉化擬南芥。提取T1代轉基因植株的DNA，PCR擴增LcCHI基因，在9個T1代植株中檢測到7個陽性苗，確定T-DNA整合到擬南芥基因組中(圖9-A)。以轉基因植株的cDNA為模板、CHI-ATG和CHI-TAG為引物進行半定量RT-PCR擴增，擬南芥AtACTIN8基因為內(nèi)參基因(引物序列見表1)，結果顯示受檢測的4個T1代轉基因株系中有LcCHI的表達，而野生型Col-0沒有檢測到LcCHI基因的表達(圖9-B)，表明紅花檵木LcCHI基因在擬南芥中異源表達。在正常的生長條件下，轉基因LcCHI的T1代植株并沒有表現(xiàn)出明顯的生長表型。

A.pLcCHI-SUPER1300載體示意圖 Schematic diagram ofpLcCHI-SUPER1300；B.pLcCHI-SUPER1300的大腸桿菌PCR鑒定，Pos為質粒陽性對照，Ng為陰性對照，帶1～4為大腸桿菌單克隆 PCR identification ofpLcCHI-SUPER1300 transferredEscherichiacoli, Pos is positive control of plasmid, Ng is negative control, bands 1 to 4 are clones ofEscherichiacoli；C.pLcCHI-SUPER1300質粒雙酶切 Double digests ofpLcCHI-SUPER1300 plasmid

圖8LcCHI過表達載體的構建
Fig.8 Construction ofLcCHIoverexpression vector

A.轉基因株系DNA的PCR擴增，帶1～9為T1代轉基因植株，Pos為質粒陽性對照 PCR amplification of transgenic lines, bands 1 to 9 are transgenic plants, Pos is positive control of plasmid；B.轉基因株系的半定量RT-PCR擴增，Col-0為陰性對照，帶1～4為轉基因株系，LcCHI和AtACTIN8基因擴增循環(huán)數(shù)為26個 Semi-quantitative RT-PCR amplification of transgenic lines forLcCHIandAtACTIN8with 26 cycles, Col-0 is negative control, bands 1-4 are transgenic lines

圖9LcCHI轉基因株系鑒定
Fig.9 Identification ofLcCHItransgenic lines

3 討 論

花青苷是植物類黃酮次生代謝物質的一個分支途徑，其在植物器官中的含量及種類與相應的器官顏色緊密相關[14]。植物花青苷的生物合成途徑酶類已經(jīng)得到深入的了解，其中前期關鍵合成酶類有查爾酮合成酶(Chalcone synthesis，CHS)、查爾酮異構酶CHI和黃烷酮-3-羥化酶(Flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H)，后期關鍵酶主要有二氫黃酮醇-4-還原酶(Dihydroflavonol-4-reductase，DFR)、花青素合成酶(Anthocyanidin synthase，ANS)和UDPG-類黃酮葡萄糖轉移酶(UDPG-flavonoid glucosyltransferase，UFGT)，這些酶類活性的改變都可能引起相應器官中花青苷含量及顏色的變化[14-15]。

CHI是花青苷生物合成途徑的第二個關鍵酶類，也是影響包括花青苷物質在內(nèi)的多種類黃酮物質合成的限速酶。利用CHI酶活性缺失的材料，確定CHI基因在多種觀賞植物花青苷生物合成過程中起重要作用。Miyahara等[11]的研究表明，康乃馨的一個CHI基因(Dca60979)的高表達與紅色花的生成緊密相關，Dca60979基因轉錄提前終止導致花瓣積累查爾酮而形成橘黃色花。對翠菊和仙來客的黃色花形成機制研究發(fā)現(xiàn)，黃色花品種中查爾酮異構酶CHI的活性缺失，花青苷合成途徑被阻斷，花朵中積累查爾酮物質而顯黃色[16-17]。利用轉基因技術，研究人員也對CHI基因的功能進行分析。Nishihara等[18]利用RNAi技術對煙草中NtCHI基因功能進行分析，發(fā)現(xiàn)NtCHI表達的下調會引起花朵內(nèi)包括花青苷在內(nèi)的總黃酮物質含量的降低，同時花色變淺。將牡丹的PsCHI1基因轉入煙草中，轉基因材料中總黃酮醇和黃酮物質含量提升兩倍，但是花瓣中花青苷物質的含量降低、花瓣顏色變淡[19]。在番茄中異源表達矮牽牛的PhCHI-A基因，轉基因番茄的果皮和果肉中黃酮醇物質含量分別比對照材料增加78倍和21倍，提高了果實的營養(yǎng)價值[7]。在煙草中異源表達水母雪蓮的SmCHI基因也可以提高總黃酮物質的含量[20]。在黃芩毛狀根中過表達SbCHI合成酶基因可提高多種類黃酮物質含量，而抑制毛狀根中SbCHI基因的表達會降低類黃酮物質產(chǎn)量[21]。因此，植物中CHI酶活性對于花青苷物質的合成是必須的，CHI酶活性的缺失或降低可用于培育淡顏色花卉品種；而CHI酶活性的增強除用于培育不同顏色的觀賞植物新品種外，也可用于培育總黃酮類含量高的植物品種，提升其藥用或食用價值。

本研究還克隆了紅花檵木LcCHI基因的ORF，并構建pLcCHI-SUPER1300過表達載體，在擬南芥中異源表達該基因并獲得轉基因植株。正常生長條件下，在多個LcCHI過表達T1代株系中并沒有觀察到明顯的生長表型，也沒有引起花青苷含量的累積，可能是因為轉基因株系中合成其他的類黃酮物質(如黃酮醇、異黃酮、原花色素等)。LcCHI的過量表達對擬南芥中類黃酮物質積累的影響還需要進一步分析。在后面的研究中，將利用高效液相色譜[16]和DMACA法[22]對擬南芥轉基因植株的黃酮醇、原花色素等類黃酮物質的累積進行分析，以獲得LcCHI基因的生理學功能。為了確定LcCHI在紅花檵木中的生物學功能，以后在建立起紅花檵木遺傳轉化的基礎上，將利用CRISPR/Cas9技術敲除該基因[23]，從而進一步了解該基因在紅花檵木生長發(fā)育及花青苷合成中的作用。