李昊文 王雅杰 沈宓 李子瑞 曹敬麗 隋濱濱 高培毅

[摘要]目的 研究PR OCR基因多態(tài)性位點n;867186與中國人群缺血性腦卒中患者頸動脈斑塊纖維帽厚薄及完整性的關(guān)系。方法前瞻性納入本院收治的缺血性腦卒中患者，采集人口統(tǒng)計學資料及腦卒中風險因素等臨床信息，頸動脈高分辨磁共振（MRI）判斷頸動脈粥樣硬化斑塊纖維帽厚薄，依據(jù)纖維帽厚度及完整程度對納入患者進行分組。利用Real-dme PCR方法，使用TaqMan探針對厚/完整型纖維帽組及薄/破損型纖維帽組患者PROM基因多態(tài)性位點rs867186進行基因分型。結(jié)果 本研究共納入176例缺血性腦卒中患者，其中95例頸動脈斑塊具有厚/完整型纖維帽，81例具有薄/破損型纖維帽。對兩組患者PROM基因n867186位點多態(tài)性分析顯示，等位基因A是形成薄/破損型纖維帽斑塊的風險因素（OR=2.89，95% CI：1.03～8.06，P=0.04），其基因頻率在厚/完整型纖維帽組和薄/破損型纖維帽組中分別為91.58%和96.91%。結(jié)論PROM基因多態(tài)性位點rs867186與頸動脈粥樣硬化斑塊纖維帽變薄/破損相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]PROM;單核苷酸多態(tài)性;缺血性腦卒中;動脈粥樣硬化;斑塊;纖維帽

中圖分類號：R543.4 文獻標識碼：A 文章編號：1009-816X（2019）05-0394-04

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.05.002

在中國，腦卒中發(fā)病率呈逐年上升趨勢。腦卒中由于其高發(fā)病率和高致死率，已成為世界各國共同面臨的公共健康問題[1]。動脈粥樣硬化易損斑塊破損引發(fā)的血栓栓塞是缺血性腦卒中主要的致病因素[2]。及時識別易損斑塊患者并進行干預治療對于預防缺血性腦卒中有重要意義。診斷易損斑塊的主要標準包括：活動性炎癥、薄纖維帽及大的脂質(zhì)核心、內(nèi)皮剝脫伴表面血小板聚集、斑塊有裂隙或損傷、嚴重狹窄[3，4]。其中纖維帽的厚薄及完整性是形態(tài)學上判斷易損斑塊的主要標志之一，薄或破損的纖維帽提示該斑塊可能為易損斑塊。單核苷酸多態(tài)性（single nu-cleotide ploymorphism，SNP）是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）顯示，動脈粥樣硬化、心肌梗死等復雜疾病與許多基因的SNP相關(guān)[5，6]?；虻牟煌鄳B(tài)性不僅影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，還可能與動脈粥樣硬化斑塊的易損性相關(guān)。2017年，研究人員通過基因芯片及meta分析，發(fā)現(xiàn)蛋白C受體（endothelial protein C re-ceptor，PROCR）基因SNP位點rs867186可能與動脈粥樣硬化及主動脈疾病相關(guān)[7]，但該多態(tài)性位點與動脈粥樣硬化斑塊易損性及斑塊纖維帽完整性的研究未見報道。

本研究通過對176例缺血性腦卒中患者進行頸動脈高分辨率磁共振成像（MRI）檢查，判斷其頸動脈斑塊纖維帽厚薄及完整性，并對PROM基因SNP位點rS867186進行基因分型，探討PROCR基因多態(tài)性與中國人群缺血性腦卒中患者頸動脈MRI影像的纖維帽變薄或破損的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：前瞻性納入2014年5月至2017年10月期間首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院收治的缺血性腦卒中患者176例。納入標準：（1）臨床診斷為前循環(huán)、非心源性的缺血性腦卒中，診斷標準符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[8];（2）年齡40～85歲;（3）腦卒中發(fā)病后6個月內(nèi)入院;（4）患者或家屬簽署知情同意書。排除標準：（1）有MRI檢查禁忌證;（2）對釓對比劑過敏;（3）心源性腦卒中或動脈炎等其他病因?qū)е碌娜毖X卒中病變;（4）既往行頸動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)或支架置入術(shù);（5）既往行頸部放療;（6）既往肝腎病史及行肝移植患者。研究方案經(jīng)過首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院倫理委員會批準，批準編號為KY2014-004-04。

1.2 方法：收集研究對象基本臨床資料，包括人口統(tǒng)計學信息（性別、年齡）、身高、體重、收縮壓、舒張壓、腦卒中危險因素[高血壓、糖尿病、高脂血癥、既往短暫性腦缺血發(fā)作（transient ischemic attack，TIA）或腦卒中史、吸煙史、腦卒中家族史、心肌梗死家族史]、基本實驗室檢查[甘油三酷（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、空腹血糖（FBG）、糖化血紅蛋白（GHb）]等。使用Trio Tim 3.0T超導MR設備（Siemens Medical Systems，德國）對納入患者進行頸動脈高分辨率MRI檢查。依據(jù)頸動脈高分辨率MRI結(jié)果，按照斑塊纖維帽性質(zhì)，將患者分為厚/完整型纖維帽組95例和薄/破損型纖維帽組81例。

1.3 基因型分析：抽取患者外周血2mL，使用血液基因組DNA提取系統(tǒng)（天根生化科技有限公司）提取DNA，方法見試劑盒操作說明書。利用TaqMan探針方法對PROCR基因SNP位點rs867186進行基因分型。反應體系：DNA模板20ng，TaqMan SNP GenotypingAssays Thermo Fisher，美國，Assay ID：C-25620145-10）0.25μL，2×TaqMan Genotyping Master Mix（Thermo Fish-er）5μL，補水至10μL。7500 Fast Real-Time PCR system（Applied Biosystems，美國）儀器進行基因型檢測，反應條件如下：95℃ 10min預變性;95℃15s，60℃ 1min，重復40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學處理：使用SPSS 17.0版對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。使用Shapiro-Wilk方法對計量資料進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的以（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗;非正態(tài)分布的以中位數(shù)（M）和四分位數(shù)間距（IQR）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)和百分率（%）表示，組間比較采用χ²檢驗?；蛐团cHardy-Weinberg平衡符合程度、組間基因型及等位基因頻率差異比較使用χ²檢驗。基因型與纖維帽變薄/破損相關(guān)性用比值比（odds ratio，OR）及95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本特征：其中男131例，女45例，平均年齡（59.69±8.73）歲。兩組患者基本臨床信息比較，見表1。

2.2 PROM基因多態(tài)性位點rs867186與纖維帽完整性相關(guān)：經(jīng)過χ²檢驗厚/完整型纖維帽組和薄/破損型纖維帽組的兩組患者中，rs867186位點的基因頻率和基因型分布比例均達到Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。對PROCR基因rs867186位點的多態(tài)性分析顯示：在95例厚/完整型纖維帽組患者中，存在A/A，A/G、G/G三種基因型，在81例薄/破損型纖維帽組患者中只有A/A、A/G兩種基因型存在。A/A基因型在薄/破損型纖維帽組患者中分布比例更高，G/G基因型僅在厚/完整型纖維帽組患者中有分布。等位基因A是纖維帽變薄或破損的風險等位基因，其基因頻率在薄/破損型纖維帽組中為96.91%，在厚/完整型纖維帽組為91.58%。風險等位基因OR值為2.89（95%CI=1.03～8.06，P=0.04），見表2。

3 討論

內(nèi)皮細胞蛋白C受體（endothelial protein C recep-tor，EPCR）由PROCR基因編碼，參與激活蛋自C系統(tǒng)，發(fā)揮細胞保護、抗炎、抗凝等作用[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，PROM基因多態(tài)性與血栓性疾病、動脈粥樣硬化、腫瘤等疾病有關(guān)[10～12]。PROCR SNP位點rs867186 A/G改變會引起EPCR跨膜區(qū)域第219位絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾被幔⊿er219Gly）[13]，導致表皮生長因子受體（opitelial growth factor receptor，EGFR）結(jié)構(gòu)改變，更易被蛋白酶水解而從內(nèi)皮細胞膜上脫落，從而使活化的凝血因子Ⅴ和Ⅷ（FⅤ a和FⅧa）增加，凝血酶生成增多，靜脈血栓形成風險增加[14，15]。另有研究報道，rs867186等位基因A/G的轉(zhuǎn)變對冠心病有保護作用（OR=0.93，95%CI=0.91～0.96）[7]，但其作用機制尚不明確。

斑塊纖維帽主要由平滑肌細胞和細胞外基質(zhì)（包含膠原纖維和彈性蛋白等）組成，其中細胞外基質(zhì)在纖維帽中的含量是一個動態(tài)變化的過程，其合成與降解受多種因子調(diào)節(jié)[16]。細胞外基質(zhì)主要由血管平滑肌細胞合成與分泌，巨噬細胞、內(nèi)皮細胞分泌的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、自細胞介素（IL-s）、干擾素-γ（IFN-γ）等炎癥因子可以誘導局部平滑肌細胞發(fā)生凋亡，平滑肌細胞的數(shù)量減少和功能減弱會導致細胞外基質(zhì)合成減少，纖維帽的膠原修復障礙[17]。此外，巨噬細胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、膠原酶和彈性蛋自酶等可以降解細胞外基質(zhì)[18]。當細胞外基質(zhì)合成減少、降解增加時，纖維帽厚度變薄、強度減弱，更易破裂。

本研究通過對具有厚/完整型纖維帽和薄/破損型纖維帽的兩組缺血性腦卒中患者進行基因分型，發(fā)現(xiàn)PROM基因rs867186位點A/A基因型在薄/破損型纖維帽組患者中分布比例更高，G/G基因型在厚/完整型纖維帽組患者中分布比例更高。等位基因A是斑塊纖維帽變薄或破損的風險因素。本研究揭示PROM基因SNP位點rs867186與中國人群缺血性腦卒中患者頸動脈斑塊纖維帽完整性相關(guān)，但該多態(tài)性影響纖維帽完整性的作用機制尚需要進一步研究。我們推測PROCR基因多態(tài)性導致EGFR結(jié)構(gòu)改變，可能導致某些細胞因子的含量或活性變化，從而影響細胞外基質(zhì)合成與降解平衡，最終引起纖維帽完整性變化。本研究為尋找新的斑塊纖維帽完整性預測指標提供思路，對于指導臨床治療及腦卒中預防具有一定意義。后續(xù)研究可集中在PRO-CR基因rs867186位點多態(tài)性變化，對細胞因子水平、血管平滑肌細胞凋亡、細胞外基質(zhì)合成與降解的影響，揭示rs867186SNP位點影響纖維帽完整性的可能的分子機制。

本研究的局限性在于納入患者量較小，尚需要長期收集樣本，進一步擴大研究規(guī)模來證實PROCR基因多態(tài)性與斑塊纖維帽厚薄的相關(guān)性。另外，由于動脈粥樣硬化是全身性的復雜疾病，患者腦血管、冠狀動脈、主動脈等血管中也可能存在斑塊，本研究未對這些血管中的斑塊狀態(tài)進行評價，因此PROCR基因多態(tài)性與其他部位動脈粥樣硬化斑塊纖維帽完整性的關(guān)系尚需進一步研究。

參考文獻

[1]Zhou M，Wang H，Zhu J，et al.Cause-specific mortality for 240 causes inChina during 1990-2013：a systematic subnational analysis for the GlobalBurden of Disease Study 2013[J].Lancet，2016，387（10015）：251-272.

[2]Spacek M，Zemanek D，Hutyra M，et al.Vulnerable atheroscleroticplaque-a review of current concepts and advanced imagine J].Biomed PapMel Far Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2018，162（1）：10-17.

[3]Sun R，Wang L，Guan C，et al.Carotid atherosclerotic plaque features inpatients with acute ischemic stroke[J].World Neurosurg，2018，112：e223-e228.

[4]Naghavi M，Libby P，F(xiàn)alk h：，et al.From vulnerable plaque to vulnerablepatient：a call for new definitions and risk assessment strategies[J]：Part1.Circulation，2003，108（14）：1664-1672.

[5]McPherson R，Tybjaerg-Hansen A.Genetics of coronary artery disease J].Circ Res，2016，118（4）：564-578.

[6]van der Hay，-，t P，Verweil N.Identification of 64 novel genetic loci providesan expanded view on the genetic architecture of coronary artery disease J].Circ Res，2018，122（3）：433-443.

[7]Howson JMM，Zhao W，Barnes DR，et al.Fifteen new risk loci for coro-nary artery disease highlight arterial-wall-specific mechanisms[J].NatGenet，2017，49（7）：1113-1119.

[8]中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會.中國急性缺血性腦卒中診治指南2014[J].中華神經(jīng)科雜志，2015 ，48（4）：246-257.

[9]Pendurthi UR，Rao LVM.Endothelial cell protein Creceptor-dependentsignaling[J].Curr Opin Hematol，2018，250）：219-226.

[10]Wojtukiewiez MZ，Hempel D，Sierko E，et al.Endothelial protein Cre-ceptor（EPCR），protease activated receptor-1（PAR-1）and their interplayin cancer growth and metastatic dissemination[J].Cancers（Basel），2019，11（1）：pH：E51.

[11]Cole JW，Xu H，Ryan K，et al.Genetics of the thrombomodulin-en-dothelial cell protein C receptor system and the risk of early-onset ischemicstroke[J].PLoS One，2018，13（11）：e0206554.

[12]Anastasou G，POlltou M，Rallidis L，et al.Endothelial protein C recep-tor gene variants and risk of thrombosis[J].Clin Appl Thromb Hemost，2016，22（2）：199-204.

[13]van Zyl N，Milford EM，Dial）S，et al.Activation of the protein C path-way and endothelial glycocalyx shedding is associated with coagulopathy inan ovine model of trauma and hemorrhage[J].J Trauma Acute Care Surg，2016，81（4）：674-684.

[14]Wildhagen KC，Lutgens E，Loubele ST，et al.The structure-function re-lationship of activated protein C.Lessons from natural and engineered mu-tations[J].Thromb Haemost，2011，106（6）：1034-1045.

[15]Dennis J，Johnson CY，Adediran AS，et al.The endothelial protein C re-ceptor（PROCR）Ser219Gly variant and risk of common thrombotic disor-ders：a HUGE review and meta-analysis of evidence from observationalstudies[J].Blood，2012，119（10）：2392-2400.

[16]Sakakura K，Nakano M，Otsuka F，et al.Pathophysiology of atheroscle-rosis plaque progression J].Heart Lung Circ，2013，22（6）：399-411.

[17]Bennett MR，Sinha S，Owens GK.Vascular smooth muscle cells inatherosclerosis[J].Circ Res，2016，118（4）：692-702.

[18]Lin J，Kakkar V，LU X.Impact of matrix metalloproteinases onatherosclerosis[J].Curr Drug Targets，2014，15（4）：442-453.

（收稿日期：2019-5-9）

基金項目：國家自然科學基金國際合作交流項目（編號：81361120402）;國家自然科學基金面上項目（編號：81572474）

作者單位：1.100070 首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院國家神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心;2.100015首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院檢驗科;3.100070 首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)放射科;4.100070 北京市神經(jīng)外科研究所

作者簡介：李昊文（1983-），博士，副研究員

通訊作者：高培毅，博士，主任醫(yī)師，E-mail：cjr.gaopeiyi@vip.163.com