律文堂　尹靜靜　陰筱　徐國(guó)鑫　吳小賓　李效尊　吳修

摘要：基因編輯技術(shù)為植物基因功能研究和作物遺傳改良提供了有效途徑。目前基因編輯植株基因分型多采用PCR/RE法、PAGE檢測(cè)法、Sanger測(cè)序法等手段，但這些方法存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)或成本高等問(wèn)題。PARMS技術(shù)（penta-primer amplification refractory mutation system，五引物擴(kuò)增受阻突變體系）是最新開(kāi)發(fā)出的基于熒光檢測(cè)的SNP基因分型方法，具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、成本低的優(yōu)勢(shì)。本研究利用PARMS技術(shù)對(duì)水稻CRISPR/Cas9基因編輯植株進(jìn)行了基因分型，鑒定結(jié)果與PAGE檢測(cè)和Sanger測(cè)序法一致，證明PARMS技術(shù)可用于水稻基因編輯植株后代基因分型，也為其它作物基因編輯后代基因分型技術(shù)選擇提供了參考。

關(guān)鍵詞：水稻;基因編輯;基因分型;五引物擴(kuò)增受阻突變體系（PARMS）

中圖分類(lèi)號(hào)：S511.035.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）10-0008-06

Application of PARMS Technology in Genotyping of

Rice Gene Edited Progeny

Lü Wentang， Yin Jingjing， Yin Xiao， Xu Guoxin， Wu Xiaobin， Li Xiaozun， Wu Xiu

（Shandong Rice Research Institute/ Hydrobiology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China）

Abstract Gene editing technology provides an effective method for plant gene function research and crop genetic improvement. At present， genotyping of gene edited plants often adopts PCR/RE， PAGE or Sanger sequencing methods， which have disadvantages such as complicated operation， long time consuming or high cost. PARMS （Penta-primer amplification refractory mutation system） technology is a newly developed SNP genotyping method based on fluorescence detection， which has the advantages of simple operation， short time consuming and low cost. In this study， the rice CRISPR/Cas9 gene edited plants were genotyped by PARMS and the results were consistent with that detected by PAGE and Sanger sequencing methods， which proved that PARMS technology could be used for genotyping of rice gene edited progeny. This study also provided a reference for the selection of genotyping techniques of other crops.

Keywords Rice; Gene editing; Genotyping; Penta-primer amplification refractory mutation system （PARMS）

突變體是研究基因功能和進(jìn)行作物新品種選育的重要材料，獲得突變體的傳統(tǒng)辦法主要依靠自然突變、物理或化學(xué)誘變及T-DNA隨機(jī)插入等手段，但這些手段存在突變效率低、突變位點(diǎn)隨機(jī)等缺陷?；蚓庉嫾夹g(shù)可以在特定的位點(diǎn)引入核苷酸變異，能夠?qū)崿F(xiàn)基因定點(diǎn)編輯從而高效地獲得目標(biāo)突變體，其快速發(fā)展與應(yīng)用為植物功能基因研究和作物遺傳改良提供了重要的技術(shù)支撐[1]。CRISPR/Cas9技術(shù)由于具有載體構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單、編輯效率高等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前主流的基因編輯技術(shù)，在擬南芥、水稻、玉米、小麥、煙草等植物基因編輯研究中被廣泛應(yīng)用[2-4]。

從基因編輯植株后代中獲得靶基因純合突變體是遺傳和育種研究中的重要環(huán)節(jié)，其篩選工作量往往較大。目前鑒定基因編輯純合體的主要方法有PCR/RE法（polymerase chain reaction / restriction enzyme assay）、PAGE檢測(cè)法、Sanger測(cè)序法、高通量測(cè)序法、HRM法（high-resolution melting analysis）、ACT-PCR法（annealing at critical temperature PCR）等[5，6]，其中PCR/RE、PAGE和Sanger測(cè)序法最為常用，但存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)或成本高等缺點(diǎn)。

PARMS技術(shù)（penta-primer amplification refractory mutation system，五引物擴(kuò)增受阻突變體系）是基于ARMS技術(shù)（tetra-primer amplification refractory mutation system，四引物擴(kuò)增受阻突變體系）[7]開(kāi)發(fā)的一種SNP基因分型技術(shù)，該技術(shù)利用五條引物（一對(duì)通用熒光引物、一對(duì)等位基因特異引物和一條反向共用引物）對(duì)SNP或短Indel位點(diǎn)進(jìn)行等位基因特異性擴(kuò)增，通過(guò)熒光掃描進(jìn)行基因分型[8]。與PCR/RE、PAGE等需要電泳進(jìn)行基因分型的傳統(tǒng)方法相比，PARMS等基于熒光檢測(cè)的基因分型方法具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短和成本低等優(yōu)勢(shì)，并且SNP及短Indel位點(diǎn)均能檢測(cè)。CRISPR/Cas9技術(shù)利用序列特異性核酸酶在靶基因PAM序列（protospacer-adjacent motif）上游3 bp位置上產(chǎn)生一個(gè)切割位點(diǎn)，隨后進(jìn)行非同源末端連接修復(fù)，產(chǎn)生隨機(jī)的短Indel突變[5]，基因編輯位點(diǎn)的突變形式大部分情況下是1 bp的插入，小部分為短片段缺失[1，3，9]。因此，理論上PARMS技術(shù)可以用于基于CRISPR/Cas9技術(shù)基因編輯后代的基因分型和純合體鑒定，但目前尚未有該技術(shù)應(yīng)用于基因編輯植株基因分型的報(bào)道。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明PARMS技術(shù)可用于水稻CRISPR/Cas9基因編輯后代的基因分型，為水稻基因編輯純合體鑒定提供了一種操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短和成本低的方案。

利用基因編輯技術(shù)對(duì)二倍體植物進(jìn)行基因編輯后，植株多產(chǎn)生簡(jiǎn)單突變。為了獲知靶點(diǎn)的突變情況，用特異引物對(duì)包含靶點(diǎn)序列的DNA片段擴(kuò)增后測(cè)序，測(cè)序峰圖可直接通過(guò)在線(xiàn)工具DSDecode解碼[10]。該方法可以簡(jiǎn)化基因編輯T₀代株系的檢測(cè)流程，不用再進(jìn)行繁瑣的TA克隆測(cè)序，提高了T₀代基因分型效率?；蚓庉婽₁等后代植株基因分型是篩選基因編輯純合突變體的手段，傳統(tǒng)的PCR/RE法、Sanger測(cè)序法等存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)或成本高等不足。特別是隨著從多位點(diǎn)敲除的基因編輯株系后代中篩選多基因純合突變單株，篩選工作量及成本較單基因敲除將呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，更加需求高效低成本的基因分型技術(shù)。PARMS技術(shù)可以把基因編輯位點(diǎn)處產(chǎn)生的短Indel轉(zhuǎn)化為SNP來(lái)檢測(cè)，針對(duì)每個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)僅需要合成三條普通引物，且擴(kuò)增程序只需在普通PCR儀上進(jìn)行，PCR產(chǎn)物經(jīng)熒光信號(hào)值掃描即可實(shí)現(xiàn)基因分型[8]。將DSDecode解碼技術(shù)與PARMS技術(shù)結(jié)合，提高了基因編輯后代的鑒定效率，降低了試驗(yàn)成本，為作物遺傳和分子育種研究中基因編輯材料的鑒定提供了一種新的技術(shù)選擇。

參 考 文 獻(xiàn)：

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收稿日期：2019-08-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31601650）;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CXGC2018E16）;雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢大學(xué)）開(kāi)放課題基金項(xiàng)目（KF201902）

作者簡(jiǎn)介：律文堂（1982—），男，博士，助理研究員，研究方向?yàn)榉肿舆z傳學(xué)。E-mail：lvwentang2015@163.com

通訊作者：李效尊（1979—），男，博士，副研究員，研究方向?yàn)樗参镌耘嗯c育種。E-mail：xiaozunli@163.com

吳修（1965—），男，研究員，研究方向?yàn)樽魑镌耘嗯c育種。E-mail：wuxiu9090@163.com