陳新　徐麗　張力思　宗曉娟　魏海蓉　王甲威　譚鉞　朱東姿　洪坡　劉慶忠

摘要：角鯊烯環(huán)氧化酶（SQE）催化角鯊烯合成三萜類骨架β-香樹酯前體2，3氧化鯊烯，是熊果酸合成途徑中的重要限速酶。本研究采用RT-PCR 技術(shù)從‘喜來藍(lán)莓根中克隆得到VcSQE基因，全長(zhǎng)序列1 744 bp，序列分析結(jié)果表明，其含有1 620 bp開放閱讀框，編碼539個(gè)氨基酸;氨基酸同源序列分析表明，藍(lán)莓與其它物種SQE蛋白氨基酸序列相似性很高，與山茶科的茶相似性最高，達(dá)90.6%，與獼猴桃相似性為89.7%;不同植物SQE蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，該類植物SQE含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，均在VcSQE中存在;熒光定量試驗(yàn)表明，VcSQE基因在葉中表達(dá)量最高，根中表達(dá)量最低。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓;角鯊烯環(huán)氧化酶基因;生物信息學(xué)分析;熒光定量

中圖分類號(hào)：S663.9：Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）10-0001-07

Cloning and Expression Analysis of a SQE Homologous Gene from

Blueberry（Vaccinium corymbosum L.）

Chen Xin， Xu Li， Zhang Lisi， Zong Xiaojuan， Wei Hairong， Wang Jiawei， Tan Yue，

Zhu Dongzi， Hong Po， Liu Qingzhong

（Shandong Institute of Pomology/Shandong Provincial Key Laboratory of Fruit Tree Biotechnology， Taian 271000， China）

Abstract Squalene epoxidase （SQE） catalyzes the synthesis of triterpenoid β-fragrant resin precursor 2，3 squalene. It is an important rate-limiting enzyme in the ursolic acid synthesis pathway. The VcSQE gene was cloned from the Xilai blueberry root by RT-PCR with the full-length sequence as 1 744 bp. The sequence analysis showed that its open reading frame was 1 620 bp，and it encoded 539 amino acids. The amino acid homologous sequence analysis showed that the amino acid sequence of SQE protein in Vaccinium corymbosum L. was very similar to others. The highest similarity was 90.6% with that of tea in Camellia， and the similarity with Actinidia chinensis var. chinensis was 89.7%. Plant SQE had 3 conserved domains， and they were all present in VcSQE. The fluorescence quantitative experiments showed that the VcSQE gene had the highest expression in blueberry leaves and the lowest in roots.

Keywords Vaccinium corymbosum L.; Squalene epoxidase（SQE）;Bioinformatic analysis;Fluorescence quantitative

藍(lán)莓作為一種高營(yíng)養(yǎng)和高市場(chǎng)價(jià)值的水果，在中國(guó)的栽培面積和栽培種類日趨增多，而伴隨藍(lán)莓采后加工工藝的研發(fā)和優(yōu)化，市場(chǎng)需求量越來越高[1-5]。藍(lán)莓含有水果中普遍存在的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)糖、酸、礦物元素等，同時(shí)也含有大量尼克酸、黃酮等[6-8]。此外，還含有三萜類物質(zhì)熊果酸和齊墩果酸[9]。

熊果酸（ursolic acid， UA）是存在于植物中的五環(huán)三萜類化合物，以游離酸或皂苷的糖苷配基形式存在。已被證實(shí)存在于許多藥用植物中，如枇杷、粳稻、迷迭香、白花蛇舌草，蘋果、梨和李子的蠟層中也發(fā)現(xiàn)有熊果酸存在[10]。因其具有一定的生物活性和低毒特性，現(xiàn)已成為許多生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。已有研究證明熊果酸具有抗腫瘤、保肝、消炎等多種功效，能夠抵抗多種致癌及促癌物[11]，并在抗氧化、拮抗微生物、降低血脂、鎮(zhèn)痛、保護(hù)心血管、抗動(dòng)脈粥樣硬化和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮作用[12，13]。另外，Kunkel等[14]研究發(fā)現(xiàn)，一些熊果酸可以增加骨骼肌Akt活性，并刺激非肥胖小鼠的肌肉生長(zhǎng);Close等[15]提出熊果酸能夠通過抑制肌肉萎縮基因以及增強(qiáng)胰島素和IGF-I信號(hào)途徑來增加肌肉量，可以作為運(yùn)動(dòng)補(bǔ)劑;De Almeida等[16]認(rèn)為熊果酸應(yīng)用于化妝品中可起到促進(jìn)皮膚表皮細(xì)胞更新、抗刺激、抗菌作用。

三萜類化學(xué)物質(zhì)的合成主要依賴類異戊二烯代謝途徑[17]。兩分子的法尼基焦磷酸在鯊烯合酶的催化下，生成一分子鯊烯[18]，生成的鯊烯在角鯊烯環(huán)氧化酶（SQE）催化下形成2，3-氧化鯊烯，2，3-氧化鯊烯作為三萜類物質(zhì)骨架β-香樹酯的直接前體物質(zhì)對(duì)三萜類物質(zhì)的合成具有十分重要的意義[19]。所以，對(duì)控制鯊烯環(huán)氧化酶合成的SQE基因的研究顯得尤為重要，有助于我們?cè)诜肿铀缴侠没蚬こ淌侄螌?shí)現(xiàn)三萜皂苷的規(guī)?；a(chǎn)。

角鯊烯環(huán)氧化酶在大多數(shù)植物體內(nèi)以多拷貝形式存在，因此SQE基因以基因家族的形式存在。擬南芥中確定了6種假定的角鯊烯環(huán)氧化酶，在酵母中通過異源表達(dá)證明其中3種酶SQE1、SQE2和SQE3的催化功能?？蒲腥藛T發(fā)現(xiàn)擬南芥sqe1突變體存在嚴(yán)重的發(fā)育缺陷，根系生長(zhǎng)較弱，并且下胚軸伸長(zhǎng)受限;成熟擬南芥sqe1-3、sqe1-4突變體株高降低，種子無法存活;sqe1-3突變體積累角鯊烯。因此，SQE1對(duì)于植物正常生長(zhǎng)發(fā)育是必要的，擬南芥突變體中剩余的5個(gè)SQE1樣基因與SQE1并非完全冗余，可能存在協(xié)同作用或其它作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，印度楝（Azadirachta indica）中有6種SQE基因，且6種基因在根和葉中均有差異表達(dá)[21]，而吊蘭（Chlorophytum borivilianum）僅在葉中CbSE表達(dá)量較高[22]。

本研究試圖從藍(lán)莓根中克隆SQE基因并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，同時(shí)，利用qRT-PCR檢測(cè)藍(lán)莓不同組織中的SQE基因相對(duì)表達(dá)情況，以期為探明角鯊烯環(huán)氧化酶在不同物種間的保守性及進(jìn)化關(guān)系和進(jìn)一步探究SQE基因表達(dá)與三萜皂苷類含量的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用試材‘喜來藍(lán)莓根取自山東省果樹研究所泰東苗圃基地。取材后用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

利用TaKaRa MiniBEST Plant RNA提取試劑盒提取藍(lán)莓根RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶的完整性。將提取后的RNA參照abmgood 5X All-In-One RT MasterMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并將得到的cDNA-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 VcSQE基因的克隆

根據(jù)已知其它植物SQE基因設(shè)計(jì)獲得VcSQE基因全長(zhǎng)序列的特異性引物（表1），對(duì)cDNA產(chǎn)物進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA 0.5 μL，上下游引物F、R各0.6 μL，dNTP 1.6 μL，Taq DNA Poly-merase 0.1 μL，5×Buffer 4 μL，補(bǔ)水至終體積為20 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min;98℃變性10 s，55℃退火5 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán); 72℃延伸5 min。利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，拍照并記錄試驗(yàn)結(jié)果。再使用 OMEGA公司的凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，并將目的基因連接到克隆載體pTOPO-Blunt上，轉(zhuǎn)化、篩菌后送擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

將序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行Blast比對(duì)分析，下載其它物種序列，并利用DNAMAN軟件進(jìn)行不同物種氨基酸序列同源性分析，后利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。通過Pfam（http：//pfam.xfam.org/search#tabview=tab1）和MEME（http：//meme-suite.org/）進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)與分析。

1.5 VcSQE基因組織表達(dá)特性

所用VcSQE基因的qRT-PCR引物（表1）由通用生物公司合成。利用DBI公司的SYBR GREEN進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系20 μL：模板2 μL，正反向引物各0.5 μL，Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。利用ABI 7500 熒光定量?jī)x采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95℃ 120 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，循環(huán)40次后進(jìn)行熔解曲線分析。每樣品重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT的計(jì)算方法分析相對(duì)表達(dá)量。以藍(lán)莓青果的表達(dá)量為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 VcSQE基因的克隆

以藍(lán)莓根系為材料提取總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得1 700 bp左右的特異性條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致，初步判斷得到VcSQE基因。將PCR體系擴(kuò)至40 μL，使用凝膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，再次電泳，得到與圖1大小一致的條帶（圖2）。

2.2 VcSQE基因序列分析

利用RT-PCR 和RACE 技術(shù)從藍(lán)莓根中成功克隆VcSQE基因，序列全長(zhǎng)為1 744 bp，其開放閱讀框?yàn)? 620 bp，編碼539個(gè)氨基酸（圖3）。

2.3 VcSQE的同源序列分析

使用DNAMAN軟件對(duì)推導(dǎo)的藍(lán)莓VcSQE與其它物種的SQE氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果（圖4）顯示，藍(lán)莓與獼猴桃SQE的同源性為897%，與月季的同源性最低，僅為80.7%，與另外9種植物的同源性均在80%以上，其中與茶的同源性高達(dá)90.6%?？傮w而言，藍(lán)莓與所參考的植物中14種SQE蛋白的氨基酸序列相似性較高。

2.4 VcSQE的系統(tǒng)進(jìn)化分析和蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

為明晰藍(lán)莓與其它11種植物SQE之間的進(jìn)化關(guān)系，借助MEGA 7.0軟件，在多重比較的基礎(chǔ)上， 用最大似然法將不同植物的14種SQE蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖5）顯示，藍(lán)莓VcSQE與獼猴桃SQE為一個(gè)類群，親緣關(guān)系最近，與茶的親緣關(guān)系也較近;與其它種屬植物的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。這表明SQE基因具有種屬特異性。

通過Pfam（http：//pfam.xfam.org/search#tabview=tab1）查詢到藍(lán)莓VcSQE蛋白序列的4個(gè)保守功能結(jié)構(gòu)域，如表2所示。同時(shí)，在MEME（http：//meme-suite.org/）中找到了15個(gè)SQE植物蛋白序列中3個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域，其在藍(lán)莓VcSQE中的位置為（122～171、323～372、388～437 aa），通過與表2中保守功能結(jié)構(gòu)域位置結(jié)合分析可知NAD_binding_8位點(diǎn)在VcSQE中具有特異性，而保守結(jié)構(gòu)域2（Motif 2）蛋白序列包含于SE（214～487 aa）活性功能區(qū)，可能是植物SQE發(fā)揮酶活性的必需序列。

2.5 VcSQE基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析

本試驗(yàn)分別提取藍(lán)莓青果、紫果、花、葉、芽、根的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并利用熒光定量分析不同組織中VcSQE基因的表達(dá)情況。由圖6可以看出，不同組織中VcSQE基因相對(duì)表達(dá)量由高到低依次為葉、花、紫果、青果、芽、根。

3 討論與結(jié)論

三萜類化合物具有重要的環(huán)境效應(yīng)和良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此研究次生代謝產(chǎn)物合成的基因調(diào)控成為熱點(diǎn)領(lǐng)域。而角鯊烯環(huán)氧化酶SQE在三萜類化合物合成途徑中發(fā)揮著重要作用，是上游代謝通路中的一個(gè)關(guān)鍵酶?；诖?，本研究以‘喜來藍(lán)莓品種為試材，成功從根中克隆VcSQE基因，序列分析結(jié)果表明，VcSQE基因具有1 620 bp開放閱讀框，編碼539個(gè)氨基酸。氨基酸同源序列分析表明，藍(lán)莓與其它物種SQE蛋白氨基酸序列相似性很高，與山茶科茶的相似性最高，達(dá)90.6%，與獼猴桃的相似性達(dá)到89.7%。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明藍(lán)莓VcSQE與獼猴桃SQE為一個(gè)類群，同源序列比對(duì)結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化樹得到的結(jié)論一致。多種植物SQE蛋白序列分析結(jié)果表明，植物SQE含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，均在VcSQE中存在。熒光定量技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，VcSQE基因在藍(lán)莓葉、花、紫果、青果、芽、根組織器官中均有表達(dá)，葉中的表達(dá)量最高，根中最低，且紫果中的表達(dá)量高于青果。因此，可利用基因工程技術(shù)使SQE基因得到高效表達(dá)，一定程度上可能有助于提高三萜類物質(zhì)的合成。本研究對(duì)解釋三萜類物質(zhì)在不同組織的差異性分布以及在藍(lán)莓不同組織中的功能具有一定的參考意義。

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收稿日期：2019-05-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31500248）;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項(xiàng)目（2015YQN35）;山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系果品產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)基金項(xiàng)目（SDAIT-06-04）

作者簡(jiǎn)介：陳新（1980—），男，山東泰安人，博士，副研究員，研究方向：果樹種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種。E-mail：63249324@qq.com

通訊作者：劉慶忠（1963—），男，山東莒南人，博士，研究員，主要從事果樹生物技術(shù)與資源育種研究。E-mail：qzliu001@126.com