張冬雨 楊俊文 楊俊梅

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人民的日常生活水平也在日益提高，飲食種類和習(xí)慣也有著巨大的改變，導(dǎo)致超重和超重肥胖也日益流行，全世界的超重肥胖人數(shù)占總?cè)藬?shù)的30%左右[1]。而隨著家庭條件的改善，養(yǎng)育孩子觀念也在發(fā)生變化，喂養(yǎng)條件和方式也日漸提升，因此現(xiàn)在“小胖墩”也是到處可見[2]。有流行病學(xué)研究預(yù)計(jì)[3]，到2020年全球范圍內(nèi)兒童超重肥胖癥的發(fā)病率將超過(guò)9%。我國(guó)最近兩年統(tǒng)計(jì)，6～18歲兒童中，超重肥胖的發(fā)病率已經(jīng)占到10%左右了，城市中男孩超重肥胖的發(fā)生率能夠達(dá)到12%，女孩差不多達(dá)到6.7%，所以兒童超重肥胖癥的發(fā)病率越來(lái)越高[4]。學(xué)齡前兒童的超重肥胖問(wèn)題也十分嚴(yán)重，超重肥胖已經(jīng)嚴(yán)重影響到兒童的正常生活與健康，所以應(yīng)該對(duì)其超重肥胖的原因進(jìn)行研究[5]。

近年來(lái)有研究顯示，腸道菌群在人體內(nèi)環(huán)境中有著十分顯著的作用，和人體很多類型的疾病有關(guān)，尤其是和超重肥胖癥有著很重要的密切關(guān)系，腸道菌群的分布對(duì)兒童腸道中能量的平衡和調(diào)節(jié)意義重大[6]。本研究調(diào)查學(xué)齡前兒童超重肥胖現(xiàn)狀，并檢測(cè)學(xué)齡前兒童腸道菌群的分布，調(diào)查兒童超重肥胖和腸道菌群分布的關(guān)系，為學(xué)齡前兒童超重肥胖癥的治療和預(yù)防提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 調(diào)查本地區(qū)3所幼兒園兒童的超重肥胖情況，3所幼兒園共320人，其中男149人，女171人，年齡3～6歲，平均年齡(3.96±1.42)歲。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除因?yàn)檫z傳、藥物、內(nèi)分泌和代謝神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)的超重肥胖癥；排除有便秘、腹瀉、腸胃炎等腸道疾病的研究對(duì)象；排除1個(gè)月內(nèi)服用過(guò)抗生素和益生菌的研究對(duì)象。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 調(diào)查超重肥胖情況 測(cè)量研究對(duì)象的身高體質(zhì)量，按照國(guó)際算法計(jì)算BMI。超重肥胖標(biāo)準(zhǔn)按國(guó)際衛(wèi)生組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)，以不同年齡，不同性別的BMI指標(biāo)為基礎(chǔ)，確定超重肥胖。超重肥胖兒童為實(shí)驗(yàn)組，隨機(jī)抽取30名正常兒童為對(duì)照組，檢測(cè)其埃希氏桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、梭菌屬等腸道菌群的數(shù)量。

1.3.2 糞便采集 符合要求的研究對(duì)象，在無(wú)菌干燥的采集盒中留取新鮮晨便，保存于4 ℃，并且在4 h以內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室，保存于－80 ℃冰箱中。若無(wú)晨便習(xí)慣者，則在當(dāng)天時(shí)間內(nèi)采集，并保證4 h以內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室。

1.3.3 糞便DNA提取 －80 ℃冰箱中保存的樣本解凍后稱取1 g的糞便，用糞便基因組DNA快速提取試劑盒(北京泰百克)提取糞便的DNA。提取后于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 熒光定量PCR 熒光定量PCR采用Lightcycler 480 SYBR Green Ⅰ試劑盒(Roche，德國(guó))在Ligthcycler 480 Ⅱ PCR儀(Roche，德國(guó))上進(jìn)行。PCR引物根據(jù)埃希氏桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、梭菌屬的16sDNA的V4～V5序列設(shè)計(jì)。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板4 μL，正向引物，10 μmol/L 0.5 μL，反向引物10 μmol/L 0.5 μL，LightCycler 480 SYSR Green Ⅰ Master (2×) 10 μL，補(bǔ)充水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)采集溫度為81 ℃。反應(yīng)結(jié)束后分析擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線，以判定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。梯度稀釋已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品，同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各自基因的擴(kuò)增效率。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)結(jié)果用Excel軟件進(jìn)行計(jì)算，用單因素變量方差分析法(ANOVA)分析樣品間四種腸道菌屬的數(shù)量差異，利用Dunnettt-Test(2-sided)進(jìn)行多重比對(duì)。所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)的方式表示，利用GraphPad.Prism.v 5.0軟件進(jìn)行作圖。菌群與BMI之間的相關(guān)性采用Pearson進(jìn)行分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)齡前兒童超重肥胖現(xiàn)狀 通過(guò)檢測(cè)本地區(qū)3所幼兒園兒童的超重肥胖情況，結(jié)果顯示3所幼兒園共320人，超重肥胖的兒童有31 人，占總數(shù)的9.69%，其中男17人，女14人，年齡3～6歲，平均年齡(3.57±1.76)歲，平均BMI(22.13±0.95)。選擇的30名健康對(duì)照組兒童中，男16人，女14人，年齡3～6歲，平均年齡(3.62±1.53)歲，平均BMI(17.35±1.48)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，其平均BMI和平均體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05(表1)。

表1 兩組兒童一般資料比較(±s)

表1 兩組兒童一般資料比較(±s)

平均BMI 平均身高/cm 平均體質(zhì)量/kg對(duì)照組 17.35±1.48 1.25±2.13 18.63±4.36實(shí)驗(yàn)組 22.13±0.95 1.36±1.96 23.46±6.26 P值 0.031 0.052 0.046組別 例數(shù)30 31平均年齡/歲3.62±1.53 3.57±1.76 1.242

2.2 兩組兒童腸道菌群拷貝數(shù)的比較(表2，圖1)熒光定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組兒童糞便中埃希氏桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬和梭菌屬四種腸道菌屬的拷貝數(shù)，比較發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬和梭菌屬在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兒童中的拷貝數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中實(shí)驗(yàn)組乳酸桿菌屬拷貝數(shù)比對(duì)照組兒童的多，而梭菌屬拷貝數(shù)比對(duì)照組兒童的少；兩組的埃希氏桿菌屬、雙歧桿菌屬拷貝數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 兩組兒童腸道菌群拷貝數(shù)的比較(Log 16SrRNA copies/g feces)

表2 兩組兒童腸道菌群拷貝數(shù)的比較(Log 16SrRNA copies/g feces)

2.3 腸道菌群和BMI的相關(guān)性分析(表3) 采用Pearson分析腸道菌群和BMI的相關(guān)性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，埃希氏桿菌屬和雙歧桿菌屬與兒童的BMI沒(méi)有顯著的相關(guān)性(P＞0.05)、乳酸桿菌屬與兒童的BMI呈現(xiàn)正相關(guān)性，且有顯著性意義(r＝0.064，P＜0.05)，而梭菌屬和與兒童的BMI呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，且有顯著性意義(r＝－0.173，P＜0.05)。

表3 腸道菌群和BMI的相關(guān)性分析

3 討論

肥胖癥已經(jīng)是全球性問(wèn)題，隨著其發(fā)病率的逐年增多，大家已經(jīng)意識(shí)到肥胖是一種病理狀態(tài)。超重肥胖的危害很多，而兒童肥胖的危害更加嚴(yán)重和長(zhǎng)遠(yuǎn)[7]。例如肥胖會(huì)增加患2型糖尿病(T2MD)的風(fēng)險(xiǎn)；相比正常體質(zhì)量的兒童超重肥胖兒童患代謝綜合征(簡(jiǎn)稱MS)的可能性增加一半；對(duì)于超重肥胖的兒童，當(dāng)其進(jìn)入青春期階段后，會(huì)容易出現(xiàn)經(jīng)期紊亂，還增加了患早期多囊卵巢綜合征的可能性；另外心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、身體外形、皮膚病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的患病概率也增加很多[8]。本研究調(diào)查分析了本地區(qū)3所幼兒園的兒童超重肥胖的情況，調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)超重肥胖的兒童有31人，占總數(shù)的9.69%，其中男17人，女14人，年齡3～6歲，平均年齡(3.57±1.76)歲，平均BMI(22.13±0.95)。

近年來(lái)的研究表明，超重肥胖不僅僅是由于攝入的營(yíng)養(yǎng)、能量代謝和運(yùn)動(dòng)失去平衡等外在因素和遺傳等內(nèi)在因素結(jié)合所導(dǎo)致的，腸道菌群也是肥胖的一大重要的環(huán)境因素[9]。有國(guó)外研究者研究結(jié)果表明[10]，腸上皮和消化系統(tǒng)的黏膜免疫組織以及腸道菌群一起構(gòu)成了一個(gè)強(qiáng)大的腸內(nèi)代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)。腸道菌群可以調(diào)節(jié)宿主的免疫和消化系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)代謝，甚至可以控制宿主的基因?qū)?chǔ)存脂肪的吸收，改變宿主的能量平衡。當(dāng)腸道菌群的結(jié)構(gòu)被破壞而失去平衡時(shí)，會(huì)導(dǎo)致宿主體內(nèi)的內(nèi)毒素增加，從而引發(fā)慢性炎癥、肥胖、胰島素抵抗等[11]。江美玲等研究者研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者的腸道菌群失去平衡，而且發(fā)現(xiàn)擬桿菌屬、球形梭菌等細(xì)菌的數(shù)量和患者的血糖濃度有著密切的相關(guān)性[12]。本研究結(jié)果分析顯示超重肥胖兒童的腸道菌群發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌屬和梭菌屬在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兒童中的拷貝數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中實(shí)驗(yàn)組乳酸桿菌屬拷貝數(shù)比對(duì)照組兒童的多，而梭菌屬拷貝數(shù)比對(duì)照組兒童的少。分析超重肥胖和四種腸道菌群的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，埃希氏桿菌屬和雙歧桿菌屬與兒童的BMI沒(méi)有顯著的相關(guān)性，乳酸桿菌屬與兒童的BMI呈現(xiàn)正相關(guān)性，且有顯著性意義，而梭菌屬和與兒童的BMI呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，且有顯著性意義。本研究結(jié)果為學(xué)齡前兒童超重肥胖癥的治療和預(yù)防提供研究基礎(chǔ)與指導(dǎo)。