陳光富

（麗江師范高等專(zhuān)科學(xué)校應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，云南麗江674199）

大型真菌通常是指子實(shí)體較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的一類(lèi)真菌，俗稱(chēng)為傘菌、蘑菇或蕈菌等[1]，是菌物的重要組成類(lèi)型。典型的傘菌子實(shí)體常由菌柄、菌環(huán)、菌褶或菌管、菌托、菌蓋、子實(shí)層、鱗片等部分組成。子實(shí)層是由擔(dān)子構(gòu)成的可育層，菌褶或菌管是子實(shí)層的著生部位，多數(shù)傘菌子實(shí)層著生于菌蓋下方，擔(dān)子成熟后釋放出擔(dān)孢子[2]。大型真菌在地球環(huán)境保護(hù)和化學(xué)物質(zhì)循環(huán)中起著重要作用，與森林植被形成共生關(guān)系，通過(guò)參與物質(zhì)分解、富集重金屬等過(guò)程，發(fā)揮保護(hù)環(huán)境的作用。其次，大型真菌也可用于食用、藥用和觀(guān)賞等方面。在我國(guó)，真菌資源較為豐富，目前已有17 000 余種被發(fā)表報(bào)道[3]。在大型真菌分類(lèi)鑒定中，擔(dān)孢子的形狀、顏色、大小、表面特征、孢子壁厚度等是分類(lèi)鑒定的主要參考數(shù)值，擔(dān)孢子形態(tài)觀(guān)察是常用方法。目前，觀(guān)察擔(dān)孢子特征的方法主要有孢子印肉眼觀(guān)察、臨時(shí)裝片光學(xué)顯微觀(guān)察和電鏡標(biāo)本掃描觀(guān)察。

1 孢子印肉眼觀(guān)察

1.1 試劑與器材

刀片或剪刀、不同顏色的薄紙片、培養(yǎng)皿、白乳膠或雞蛋清提取液、過(guò)塑機(jī)、硬卡紙、新鮮完好子實(shí)體、燒杯、清水。

1.2 制作方法[4-8]

選取不同對(duì)比色的薄紙片平鋪在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上，將切除菌柄后的子實(shí)體（菌蓋）菌褶向下平鋪于紙片上，罩上培養(yǎng)皿，在室內(nèi)靜置6～48 h，可根據(jù)不同傘菌種類(lèi)或菌蓋大小適當(dāng)設(shè)置靜置時(shí)間。設(shè)定時(shí)間到后，輕輕移去培養(yǎng)皿和菌蓋，可以看到在紙片上遺留有按菌褶呈放射狀排列的大量孢子，這就制成了孢子印或孢子堆。為使孢子印上的孢子干后不脫落，可以在紙上涂一層白乳膠或雞蛋清提取液，等晾干后進(jìn)行簡(jiǎn)易保存；如果要長(zhǎng)期保存，則在晾干的孢子印后背墊上硬卡紙，過(guò)塑保存。

在制作過(guò)程中需根據(jù)孢子的顏色，選擇具有顏色反差的紙，比如孢子是白色則選擇黑色紙或半黑半白紙，其他顏色的孢子則選擇白色紙。如果要縮短孢子印的制作時(shí)間，在接取孢子的薄紙中央剪取適中的開(kāi)口，將菌柄穿過(guò)開(kāi)口浸入盛有適量清水的燒杯中，將菌蓋平鋪在薄紙上并在室內(nèi)避風(fēng)靜置，2～4 h后即可得到清晰的孢子印。

1.3 觀(guān)察內(nèi)容

孢子印的制作原理是根據(jù)傘菌類(lèi)擔(dān)孢子成熟時(shí)，在孢子和小梗連接處會(huì)分泌出布勒氏液滴，液滴在短時(shí)間內(nèi)會(huì)膨大，在孢子彈射時(shí)由孢子攜帶離開(kāi)小梗的原理制成的。擔(dān)孢子的數(shù)目很大，單一的孢子在顯微鏡下呈現(xiàn)出無(wú)色或有色，當(dāng)大量孢子堆積在一起時(shí)能夠呈現(xiàn)出該菌類(lèi)獨(dú)具的顏色，而呈現(xiàn)的這種顏色則是菌類(lèi)分科分述檢索鑒定的重要特征之一。因此，制作的孢子印可直接用肉眼觀(guān)察顏色，根據(jù)孢子印的顏色常把傘菌分為粉紅孢子類(lèi)、黃—褐孢子類(lèi)、紫褐—黑色孢子類(lèi)和白色孢子類(lèi)等[3]。其次，可以用手指輕輕觸碰孢子粉末，能夠直觀(guān)感受到因孢子壁結(jié)構(gòu)不同而產(chǎn)生光滑或晦澀的觸摸感[7]。

2 光學(xué)顯微鏡觀(guān)察

2.1 試劑與器材

顯微鏡、電腦（拍攝軟件）、載玻片、蓋玻片、中性紅染液、顯微鏡、浮載劑（5%～10%KOH）、剛果紅染液、單面刀片、鑷子、吸水紙、解剖針、蒸餾水、接種環(huán)等。

2.2 制作方法

孢子裝片觀(guān)察。先取載玻片置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在載玻片中央位置滴1 滴中性紅，然后在孢子印上用接種環(huán)或解剖針沾取部分孢子粉或用接種環(huán)在菌蓋的菌褶兩側(cè)、子實(shí)層表面涂取孢子粉，將涂取的孢子粉輕置于試劑上，染色5～10 min，用鑷子將蓋玻片蓋上，鏡檢觀(guān)察，可以觀(guān)察到單個(gè)孢子形態(tài)。如果在孢子印或菌褶、子實(shí)層上涂取的孢子不理想，可以將子實(shí)體的菌柄切除，將菌蓋平鋪在培養(yǎng)皿內(nèi)，24 h 后從培養(yǎng)皿中涂取孢子粉觀(guān)察[9]。

組織塊裝片觀(guān)察。取一片載玻片置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在載玻片中央位置滴上1～2 滴5%～10% KOH 浮載劑。取新鮮子實(shí)體，用徒手切片的方法，用刀片沿菌蓋徑向切取較薄的組織塊，將組織塊置于浮載劑中浸泡1～5 min，并立即觀(guān)察成色反應(yīng)。如果切取的是干標(biāo)本或者是不同菌類(lèi)標(biāo)本可以適當(dāng)延長(zhǎng)復(fù)水時(shí)間，讓組織充分展開(kāi)。浸泡過(guò)后用鑷子將蓋玻片蓋上，并在蓋玻片的一側(cè)滴上剛果紅試劑，在另一側(cè)用吸水紙吸引，使組織塊著色?；蛘咴诩由w蓋玻片前在組織塊一側(cè)滴入剛果紅試劑，并且用解剖針和吸水紙吸引將組織塊染色體均勻后在加蓋蓋玻片。將制成的裝片在顯微鏡下鏡檢觀(guān)察[10]。

2.3 觀(guān)察內(nèi)容

在光學(xué)顯微鏡下仔細(xì)觀(guān)察擔(dān)孢子的形狀、大小、顏色、孢子壁厚度、囊狀體的有無(wú)或形狀、內(nèi)含物及成色反應(yīng)等，或者測(cè)量擔(dān)孢子大小的正面觀(guān)和側(cè)面觀(guān)[10-11]，在觀(guān)察過(guò)程中需拍照記錄。

在記錄和測(cè)量過(guò)程中，一般測(cè)量孢子的長(zhǎng)度和寬度。為使測(cè)量數(shù)據(jù)更精確，如果是在新鮮子實(shí)體上取的孢子印或組織塊，根據(jù)菌肉的薄厚隨機(jī)選取10～25 個(gè)成熟孢子進(jìn)行觀(guān)察測(cè)量，如果在干標(biāo)本上取的組織塊，根據(jù)孢子大小差異隨機(jī)選取20～50 個(gè)孢子進(jìn)行測(cè)量；測(cè)量側(cè)面觀(guān)時(shí)，一般包括飾紋，附胞不計(jì)算。孢子大小范圍確定后，就可以計(jì)算出Q 值（孢子長(zhǎng)寬比），根據(jù)Q 值說(shuō)明孢子形狀[3，11]，目前常用的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)及劃分形態(tài)有7 種：①球形，Q=1.01～1.05；②近球形，Q=1.05～1.15，③寬橢圓形，Q=1.15～1.30；④橢圓形，Q=1.30～1.60；⑤長(zhǎng)方形，Q=1.60～2.0；⑥圓柱形，Q=2.0～3.0；⑦桿狀，Q＞3.0。

3 掃描電鏡觀(guān)察

3.1 試劑與器材

掃描電鏡、單面刀片、樣品臺(tái)、硅片（銅片）、噴鍍機(jī)（濺射儀等）、無(wú)水乙醇。

3.2 制作方法

目前，電鏡標(biāo)本制作常用方法是用刀片切取子實(shí)體菌蓋下菌褶或菌管的一片組織，將切取的組織放置于硅片上（銅片或者組織粘臺(tái)），用無(wú)水乙醇浸潤(rùn)5～10 s 后取出自然干燥，約0.5～1 h 后，將樣品固定在樣品臺(tái)上進(jìn)行真空鍍金[11]；或者不用浸潤(rùn)直接將樣品固定在組織粘臺(tái)直接用離子濺射儀噴金，制成電鏡標(biāo)本[12]。也有學(xué)者報(bào)道直接將濾取的孢子置于銅片或者膠面上，進(jìn)行噴鍍后制成電鏡標(biāo)本[13-15]。將電鏡標(biāo)本制作好后，放在電鏡掃描儀下進(jìn)行掃描觀(guān)察，并記錄。

3.3 觀(guān)察內(nèi)容

電鏡技術(shù)的發(fā)展為孢子壁結(jié)構(gòu)、孢子飾紋類(lèi)型等特征的觀(guān)察提供了便利，為更好觀(guān)察孢子壁結(jié)構(gòu)、孢子飾紋形態(tài)，在觀(guān)察過(guò)程中應(yīng)盡量選擇成熟飽滿(mǎn)的擔(dān)孢子進(jìn)行觀(guān)察記錄。在觀(guān)察測(cè)量過(guò)程中，一般包括長(zhǎng)度、寬度、頂瘤、側(cè)瘤的大小等，并觀(guān)察孢子表面紋飾類(lèi)型。孢子紋飾是孢子壁組織向外凸起生長(zhǎng)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)[3，11]。孢子紋飾有多個(gè)專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)描述，有學(xué)者按凹型與凸型兩大類(lèi)劃分為12 種形態(tài)描述：①穴紋：指孢子壁具圓形或近圓形的穴狀凹陷，口徑較大；②網(wǎng)紋：指孢子壁有角形凹陷；③齒狀網(wǎng)紋，指網(wǎng)紋網(wǎng)脊上有齒狀突起；④溝紋，指孢子壁上長(zhǎng)條脊與深陷的長(zhǎng)溝槽相間，不成網(wǎng)，條脊彼此多少平行或成角排列；⑤蠕蟲(chóng)紋，指孢壁具短小而彎曲的條狀凸起，似蠕蟲(chóng)；⑥顆粒狀紋，指圓顆粒狀突起，較細(xì)小，大小不等；⑦疣狀紋，指孢子壁具近半球狀突起，寬度大于高度，較顆粒紋大且較整齊；⑧瘤狀紋，指末端為鈍圓的瘤狀突起，高度大于或等于寬度；⑨棒狀紋，指孢子壁具棒狀突起，頂端圓頭鼓糙狀，高大于寬；⑩刺狀紋，指孢子壁末端一般為較尖的突起，基部較末端寬；11○塊狀紋，指孢子壁具不規(guī)則的塊狀突起，也可以是云塊狀；12○瓣?duì)罴y，指孢子壁具翅棱狀突起[15]。

4 展望

在大型真菌種類(lèi)鑒定中，隨著數(shù)值分類(lèi)、化學(xué)分類(lèi)、基因組學(xué)及分子生物學(xué)等技術(shù)的興起與推廣，菌物分類(lèi)手段與技術(shù)越來(lái)越多元化。而利用傳統(tǒng)觀(guān)察孢子印和用顯微鏡技術(shù)對(duì)擔(dān)孢子形態(tài)特征進(jìn)行觀(guān)察與測(cè)量的形態(tài)分類(lèi)手段至今仍然被沿用[1，16，17]，因?yàn)檫@種方法直觀(guān)可靠，可比性較強(qiáng)，工作開(kāi)展便利。特別是電子顯微鏡掃描鑒定技術(shù)可以清晰的觀(guān)測(cè)到擔(dān)孢子壁的表面特征、細(xì)胞內(nèi)含物、孢子紋飾等，能更加精準(zhǔn)有效的輔助分類(lèi)鑒定。因此，擔(dān)孢子形態(tài)觀(guān)察方法將同菌物的外部形態(tài)鑒定、數(shù)值分類(lèi)、化學(xué)分類(lèi)和分子數(shù)據(jù)與序列對(duì)比等技術(shù)手段一樣成為菌類(lèi)鑒定和多樣性遺傳研究的重要手段。