官麗娟 ，邵 鈺，任偉杰，宮楓舉，韓同福，鄒艷麗，孫學(xué)強(qiáng)，，吳曉東，張 志，，黃保續(xù)

（1.青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心，山東青島 266114；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是一種由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的急性、熱性、烈性動(dòng)物傳染病，病死率高達(dá)100%[1]，嚴(yán)重危及養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告疫病，我國(guó)將其列為一類傳染病[2]。ASFV 是一種大型的胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制的病毒，由核質(zhì)體、核衣殼、內(nèi)層囊膜和外層囊膜構(gòu)成。ASFV 基因組龐大，可達(dá)171～193 kb，有150多個(gè)主要開(kāi)放閱讀框，編碼約200種蛋白[3]，其中抗原性較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)性蛋白主要為p54、p220、p62、p72、p32以及CD2v 等[4]。研究發(fā)現(xiàn)，由基因E183L編碼的p54蛋白抗原性較好，它在快速入侵、吸附易感細(xì)胞中發(fā)揮很大作用，且病毒進(jìn)入機(jī)體后可產(chǎn)生針對(duì)于該蛋白的抗體[5-7]。因此，一些學(xué)者針對(duì)p54蛋白建立了ASFV 抗體檢測(cè)方法，用于ASFV 感染動(dòng)物血清的監(jiān)測(cè)[8-9]。2018年8月，我國(guó)報(bào)告首例ASF 疫情，隨后又陸續(xù)暴發(fā)超百起疫情，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大損失[10-11]。盡管國(guó)內(nèi)外已有許多研究報(bào)道了p54蛋白編碼基因的表達(dá)，但其均是基于國(guó)外毒株開(kāi)展的研究。本研究擬以我國(guó)暴發(fā)流行的ASFV（AnhuiXCGQ）作為研究對(duì)象，通過(guò)密碼子優(yōu)化后，用原核表達(dá)的方法，表達(dá)E183L基因的整個(gè)CDS 區(qū)，以期深入研究我國(guó)ASFV 流行毒株p54蛋白的抗原特性，并以此為基礎(chǔ)建立相應(yīng)的血清學(xué)診斷方法。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

ASFV 抗原、ASFV 陽(yáng)性核酸和陽(yáng)性血清，均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心驗(yàn)證和提供。

1.2 主要試劑

Ex-Taq酶、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、限制性內(nèi)切酶NdeI 和HindⅢ，購(gòu)自TaKaRa 生物技術(shù)有限公司；pET-30a（+），購(gòu)自Novogen 公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自天根生物有限公司。

1.3 p54基因特異性引物設(shè)計(jì)和序列擴(kuò)增

根據(jù)GenBank 中ASFV 中國(guó)株（China 2018/AnhuiXCGQ）p54基因序列[12-13]，設(shè)計(jì)合成1對(duì)針對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS 區(qū)）的特異性PCR擴(kuò)增引物。上游引物為：5'-CATATGATGGATTCT GAATTTTTTCA-3'；下游引物為：5'-AAGCTTTTA CAAGGAGTTTTCTAGGT-3'。擴(kuò)增E183LCDS 區(qū)片段，使擴(kuò)增目的基因長(zhǎng)度為552 bp。擴(kuò)增程序采用：94 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。在這對(duì)引物的5'端分別添加限制性內(nèi)切酶NdeI 和HindⅢ 酶切位點(diǎn)，然后以ASFV 陽(yáng)性核酸為模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增；將擴(kuò)增完的條帶切膠后，通過(guò)DNA 純化回收試劑盒回收，送生物公司測(cè)序，同時(shí)與E183L基因序列作比對(duì)。

1.4 pET-30a（+）-p54重組表達(dá)載體構(gòu)建

上述擴(kuò)增的p54 PCR 產(chǎn)物與pET-30a（+），同時(shí)用限制性內(nèi)切酶NdeI 和HindⅢ 進(jìn)行雙酶切，用DNA 純化回收試劑盒回收目的條帶；通過(guò)T4 DNA 連接酶，將雙酶切過(guò)的p54與pET-30a（+）表達(dá)載體連接過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，并分別用p54基因?qū)?yīng)的上述引物進(jìn)行菌液PCR 鑒定。同時(shí)，將挑選出的陽(yáng)性克隆菌株，通過(guò)小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后，通過(guò)限制性內(nèi)切酶NdeI 和HindⅢ 進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.5 p54蛋白表達(dá)

取50 μL pET-30a（+）-p54陽(yáng)性菌液按1：1 000接種到5 mL 含卡那霉素的LB 培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；以1：100比例，將擴(kuò)增好的菌液接種到LB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)；當(dāng)培養(yǎng)液中的OD 值為0.5時(shí)，加IPTG 至終濃度0.8 mmol/L，37 ℃條件下繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)5 h；將培養(yǎng)物離心，棄去上清，加入蛋白質(zhì)裂解液進(jìn)行裂解；繼續(xù)離心，分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。

1.6 p54表達(dá)蛋白純化

根據(jù)1.5中蛋白表達(dá)的結(jié)果，取上清液進(jìn)一步通過(guò)His 親和層析柱親和純化重組p54蛋白。

1.7 可溶性表達(dá)蛋白鑒定

將純化好的重組p54蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行Western Blot：將蛋白凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，以5%脫脂奶粉封閉；將ASFV 陽(yáng)性血清1：800倍稀釋后孵育1 h，洗滌5次；以HRP 標(biāo)記的抗豬二抗1：2 000稀釋后孵育1 h，洗滌5次；最后加入DAB 顯色，觀察重組p54蛋白的反應(yīng)原性。

2 結(jié)果

2.1 p54蛋白目的基因擴(kuò)增

以ASFV 核酸為模板，用本研究設(shè)計(jì)的1對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出大小為552 bp 的特異性條帶（圖1）。擴(kuò)增結(jié)果顯示，該條帶序列與GenBank 中ASFV p54基因同源性為100%，表明擴(kuò)增片段確為ASFV 的p54基因序列。

圖1 目的基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒pET-30a（+）-p54構(gòu)建

對(duì)擴(kuò)增得到的p54特異性片段與pET-30a（+）載體進(jìn)行NdeI 和HindⅢ 雙酶切，經(jīng)過(guò)連接、轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選后，挑選了8個(gè)白色菌落，搖菌后進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個(gè)白色菌落中有6個(gè)為陽(yáng)性，特異性條帶大小為552 bp（圖2）。選出2個(gè)陽(yáng)性克隆菌進(jìn)行質(zhì)粒提取，通過(guò)NdeI 和HindⅢ 雙酶切鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5 kb 和0.5 kb 大小左右的特異性條帶（圖3）。

圖2 重組質(zhì)粒pET-30a（+）-p54瓊脂糖凝膠電泳分析圖

圖3 重組質(zhì)粒pET-30a（+）-p54雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 p54蛋白表達(dá)

重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a（+）-p54轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）后，為確定重組質(zhì)粒的表達(dá)水平，采用兩種不同的誘導(dǎo)和表達(dá)方式，即分別經(jīng)過(guò)15 ℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h 和37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，再取上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳分析。結(jié)果可見(jiàn)，兩種誘導(dǎo)表達(dá)方式的上清和全菌中均出現(xiàn)一條分子量約為20 kDa 的特異性條帶（圖4），說(shuō)明兩種誘導(dǎo)方式都可以表達(dá)p54蛋白。其中，p54在37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h 比15 ℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h 產(chǎn)生的蛋白量明顯增高，p54蛋白在上清中的含量比在沉淀中明顯增高。

2.4 p54蛋白純化與鑒定

用His 親和層析柱純化37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌上清，對(duì)純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)純化的蛋白與預(yù)期蛋白大小一致，約為20 kDa 且純度可達(dá)95%以上；進(jìn)一步用Western Blot 進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組p54蛋白和陽(yáng)性ASFV 抗原均與ASFV 陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，在20 kDa 處可以看到一條特異性棕黃色條帶，且陰性樣本不與ASFV 陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)（圖5）。

圖4 p54蛋白的表達(dá)鑒定結(jié)果

圖5 p54蛋白純化與鑒定結(jié)果

3 討論

目前針對(duì)ASF 防控尚無(wú)有效的商品化疫苗，因此ASF 疫情的監(jiān)測(cè)與診斷變得至關(guān)重要。根據(jù)OIE 和我國(guó)ASF 診斷技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)ASFV 方法有血清學(xué)方法和病原學(xué)方法：血清學(xué)方法主要有間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和間接熒光抗體試驗(yàn)法；病原學(xué)檢測(cè)方法有直接免疫熒光法、雙抗體夾心ELISA 法、普通PCR 法和熒光PCR 法。我國(guó)在最新公布的《非洲豬瘟疫情應(yīng)急實(shí)施方案（2019年版）》中指出，雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等方法是檢測(cè)ASFV 的病原學(xué)檢測(cè)方法。

對(duì)ASFV 基因組分析表明，p54、p220、p62、p72、p32、CD2v、A104R、B602L、K205R等12種蛋白具有強(qiáng)抗原性，特別是p54、p72、p32、CD2v 等4種蛋白產(chǎn)生的抗體滴度較高，是檢測(cè)ASFV 比較好的候選抗原成分[4]。Barderas 等[14]將具有強(qiáng)抗原表位的p54/p30嵌合在一起，結(jié)果證明其免疫原性和抗原性都很強(qiáng)。龔振華等[8]參考ASFV Con09/Bzz020株原核高效表達(dá)p54蛋白，并將其應(yīng)用于ASF ELISA 檢測(cè)中。馮春燕等[15]參考NCBI 中ASFV 的E75（GenBank：FN557520.1）毒株的p54基因序列，原核表達(dá)p54蛋白并成功制備p54單克隆抗體，進(jìn)一步為ASFV ELISA 診斷技術(shù)的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。梁云皓等[16]利用Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ASFV p54蛋白，并通過(guò)Western Blot 證明其具有良好的抗原性。

基于以上研究，為避免形成包涵體和p54蛋白反應(yīng)原性丟失，本研究根據(jù)GenBank 序列號(hào)ASFV（MK128995）通過(guò)密碼子優(yōu)化后，將E183L基因的CDS 區(qū)進(jìn)行克隆表達(dá)，這不僅保留了完整的E183L基因表達(dá)產(chǎn)物，并且通過(guò)密碼子優(yōu)化，選擇優(yōu)于大腸桿菌表達(dá)的堿基，大大提高了p54蛋白的表達(dá)量。結(jié)果表明，本研究的表達(dá)策略是成功的。利用該方法，成功用原核表達(dá)載體pET-30a（+）獲得了可溶性的p54抗原；經(jīng)過(guò)Western Blot 鑒定后，發(fā)現(xiàn)純化的p54可以與ASFV 陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)；用BCA 蛋白測(cè)定方法，測(cè)定其濃度高達(dá)4 mg/mL，且純化效率高。本研究為ASF ELISA診斷試劑的開(kāi)發(fā)提供了參考。