劉麗華 ，張松山，張禧慶，孫寶忠，雷元華，修建勝，謝 鵬

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.煙臺杰科檢測服務有限公司，山東萊陽 265231）

關鍵字：“注水肉”；水分/蛋白質(zhì)；篩查；聚類分析

自20世紀80年代肉類市場放開經(jīng)營以來，“注水肉”行為一直屢禁不絕，成為嚴重危害消費者健康的食品安全問題[1-3]。原國家商務部2001年頒布實施的《畜禽肉水分限量》（GB 18394—2001）國家強制標準，為監(jiān)管部門提供了執(zhí)法依據(jù)。因當時注水手法單一，在實施初期，該標準對“注水肉”行為起到了極大的震懾作用，有效保障了人們的食品安全，取得了良好的社會效益[4-6]。然而近年來為了躲避監(jiān)查，不法商販不斷升級畜禽肉注水手法，從單純注水發(fā)展為注水與注射或灌服違法添加物相結(jié)合，以達到增大注水量，且肉中水分含量不超標的目的[7]。

與之相應的“注水肉”鑒別手段也從最初的水分含量鑒別[8-9]、感官鑒別[10]、試紙法鑒別[11]、違法添加物篩查[12]等，發(fā)展到利用低場核磁技術結(jié)合主成分分析方法，來區(qū)分生鮮肉與“注水肉”[13-14]，利用光譜技術建立“注水肉”判別模型等[15-16]。但從實效來看，這些技術手段準確性有待提高，震懾效果不佳[17]，且需要較長的檢測時間或?qū)I(yè)的檢測人員，不利于現(xiàn)場快速篩查。從生理學和病理學角度來看，肉中注水必然會造成機體或肌肉組織中，與水分存在狀態(tài)有關的某些敏感指標的特異性變化[18]。因此，本研究利用HE 染色法、核磁檢測技術和統(tǒng)計學聚類方法，以生鮮肉和“注水肉”中水分、蛋白質(zhì)、脂肪含量以及水分和蛋白質(zhì)比值為關鍵指標，來呈現(xiàn)肉品的指征性變化規(guī)律，從而達到鑒別“注水肉”的目的。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選擇相同飼養(yǎng)條件下，體質(zhì)量為（95±5）kg的杜大長三元雜交豬234頭；隨機選擇其中153頭為生鮮肉組，剩余81頭為“注水肉”組?！白⑺狻蹦Ｐ徒ⅲ合葘Α白⑺狻苯M活豬，肌內(nèi)注射現(xiàn)場收繳的違法注水添加物，2 h 后灌服6 kg 清水，以后每間隔3 h 灌服1次，連續(xù)2次，2 h 后再灌服1次。對所有試驗活豬，按照《生豬屠宰操作規(guī)程》（GB/T 17236—2008）屠宰；取左側(cè)胴體背最長肌1 kg，密封后置于4 ℃保溫箱中迅速運回實驗室，進行相關指標測定。制備HE 組織切片樣品時，取背最長肌，沿肌纖維紋理切割約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的肌肉組織塊，10%甲醛溶液固定。

1.2 試驗儀器

BS214D 型電子天平，購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KD-BM 生物組織包埋機，購自浙江金華科迪儀器設備有限公司；Nikon YS100顯微鏡，購自南京江南光電股份有限公司；Meso MR23-060H-1型臺式核磁共振分析儀，購自上海紐邁電子科技有限公司；KDY-9820型凱式定氮儀，購自北京通潤源機電技術有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 組織結(jié)構(gòu)測定參考任秋斌[20]的HE 染色法，將HE 組織切片樣品，用4%甲醛溶液浸泡48 h，再切割成0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm 大小的組織塊，用水沖洗，70%酒精脫水過夜，二甲苯透明20 min 后組織包埋、修片、切片、染色，中性樹膠封片后顯微拍照。

1.3.2 水分分布測定將樣品切割成1 cm×1 cm×1 cm 大小的塊狀，用核磁共振分析儀，測量核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）橫向弛豫時間（T2）。測定時，儀器參數(shù)設定選擇：CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill sequence）序列，測量溫度32 ℃，質(zhì)子共振頻率SF=23 MHz，偏移頻率O1=286.195 4 kHz，累加次數(shù)NS=6，采樣點數(shù)TD=384 996，PRG=1，模擬增益RG1=20，半回波時間DL1=0.12 ms，回波數(shù)NECH=14 000，P1=17 s，P2=35 us，Tw=3 500 ms。每個樣品重復測量3次。

1.3.3 營養(yǎng)成分測定參照《食品安全國家標準食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）[21]方法，測定水分含量；參照《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》（GB 5009.3—2016）[22]中第一法：凱式定氮法，測定蛋白質(zhì)含量；參照《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》（GB 5009.3—2016）[23]中第一法：索式抽提法，測定脂肪含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 軟件，處理試驗數(shù)據(jù)；采用IBM SPSS Statistics 20、成組t 檢驗方法，進行組間差異顯著性分析。分析時采用雙側(cè)檢驗，試驗數(shù)據(jù)采用均值± 標準差（mean±SD）表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。采用IBM SPSS Modeler 軟 件，使 用K-Means 析算法，對試驗數(shù)據(jù)進行聚類分析；使用反演擬合軟件V4.09（上海紐邁電子有限公司），分析水分分布的弛豫時間。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌纖維組織

生鮮肉肌纖維的縱切面組織形態(tài)（圖1-A）顯示，縱切面完整，肌細胞被白色的結(jié)締組織隔開，形態(tài)較好；肌纖維排列緊密，肌漿豐富，染色深，橫紋清晰。生鮮肉肌纖維的橫切面組織形態(tài)（圖1-B）顯示，橫斷面肌纖維排列緊密，肌漿豐富，染色均勻。

“注水肉”肌纖維的縱切面組織形態(tài)（圖1-C）顯示，縱切面完整，肌細胞邊界模糊，形態(tài)較差；肌纖維腫脹，呈卷曲波浪狀，結(jié)締組織斷裂，著色呈現(xiàn)不規(guī)則的紅白相間條紋狀（肌漿流失造成發(fā)白），有的整個肌纖維呈灰白色，也有肌纖維斷裂現(xiàn)象。“注水肉”肌纖維的橫切面組織形態(tài)（圖1-D）顯示，肌漿稀疏，著色淺淡，纖維整體排列無序。

2.2 水分分布

橫向弛豫時間測量結(jié)果（圖2）顯示：不同弛豫時間處的特征峰與肉中存在的不同狀態(tài)水是對應的，即T21、T22和T23（由左至右依次對應的峰）分別表征樣品中的結(jié)合水、不易流動水和自由水的核磁響應信號[24]。

生鮮肉和“注水肉”的弛豫時間和峰面積比的成組t 檢驗分析結(jié)果（表1）顯示：生鮮肉的T21起峰時間和峰頂時間顯著晚于“注水肉”（P＜0.05），T22結(jié)束時間顯著早于“注水肉”（P＜0.05），峰面積比P21顯著小于“注水肉”（P＜0.05），峰面積比P22顯著大于“注水肉”（P＜0.05）。

2.3 營養(yǎng)成分測定

圖1 生鮮肉和“注水肉”的肌纖維結(jié)構(gòu)

圖2 生鮮肉與“注水肉”的典型橫向弛豫時間（T2）

生鮮肉和“注水肉”營養(yǎng)成分的成組t 檢驗差異分析結(jié)果（表2）顯示：生鮮肉的蛋白質(zhì)含量顯著高于“注水肉”（P＜0.05），脂肪含量略低于“注水肉”；生鮮肉和“注水肉”的水分含量存在顯著差異，但二者數(shù)值均未超過《畜禽肉水分限量》（GB 18394—2001）所規(guī)定的限量值（77%）；生鮮肉的水分/蛋白質(zhì)比值顯著低于“注水肉”（P＜0.05）。

2.4 營養(yǎng)成分分布規(guī)律

生鮮肉和“注水肉”的水分含量分布（圖3-A）顯示，生鮮肉的水分含量為73.3%～76.6%，“注水肉”為74.2%～76.6%。二者分布區(qū)域基本重合，無法有效加以區(qū)分。生鮮肉和“注水肉”的脂肪含量分布（圖3-B）與水分含量分布呈現(xiàn)相同趨勢。

表1 T2的峰時間（ms）和面積比（%）分布

生鮮肉和“注水肉”的蛋白質(zhì)含量分布（圖3-C）顯示，生鮮肉的蛋白質(zhì)含量為20.9%～23.6%，主要集中在22%左右；“注水肉”為18.0%～22.0%，主要集中在19%左右；二者雖具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），大部分可以有效區(qū)分。

水分/蛋白質(zhì)比值的分布結(jié)果（圖3-D）顯示，生鮮肉的水分/蛋白質(zhì)比值為2.80～3.95，主要集中在3.50左右；“注水肉”的水分/蛋白質(zhì)比值為3.38～4.82，主要集中在4.00左右。二者存在明顯差異（P＜0.05），大部分可以有效區(qū)分。

表2 營養(yǎng)成分含量和水分/蛋白質(zhì)比值測定結(jié)果

圖3 水分、蛋白質(zhì)、脂肪以及水分/蛋白質(zhì)比值分布

2.5 營養(yǎng)指標聚類分析

以水分、蛋白質(zhì)、脂肪、水分/蛋白質(zhì)比值作為數(shù)據(jù)源，使用K-Means算法聚類劃分生鮮肉和“注水肉”。設置聚類數(shù)為2，得出在類別1和類別2中生鮮肉和“注水肉”的個數(shù)（表4）。以水分和脂肪分別作為聚類分析項，結(jié)果顯示生鮮肉和“注水肉”的分布差異不顯著（P＜0.05）。以蛋白質(zhì)和水分/蛋白質(zhì)比值分別作為聚類分析項，結(jié)果顯示生鮮肉和“注水肉”在兩個類別中分布差異都較大（P＜0.05）。利用類別1中“注水肉”識別個數(shù)除以“注水肉”樣品總數(shù)計算“注水肉”識別率，各分類項的“注水肉”識別率為80.2%、79.0%、80.2%和88.9%；利用類別2中生鮮肉的識別個數(shù)除以生鮮肉總數(shù)，計算各分類項的生鮮肉識別率分別為49.7%、94.8%、49.7%和96.7%。結(jié)果可見，水分/蛋白質(zhì)的識別率高于其他分類項。

表4 聚類分析聚類中樣品個數(shù)結(jié)果

3 討論

HE 染色是肌肉組織學觀察的主要方法[25]。李志強[26]研究發(fā)現(xiàn)，生鮮豬肉組織的肌纖維排列整齊且紋理清晰可辨別。王彥麗等[27]研究發(fā)現(xiàn)，注水行為可使肌細胞滲透壓發(fā)生顯著變化，造成肌細胞破裂，組織形態(tài)破壞，因而“注水肉”組織結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)肌肉色澤變淡和結(jié)締組織紅白花紋不明顯的特點。本研究的生鮮豬肉和“注水肉”組織觀察結(jié)果與以上研究一致。

通常認為LF-NMR 多組分橫向弛豫圖中，T21反映了與大分子緊密結(jié)合的水分，T22反映了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的水分，而T23則反映了肌纖維外蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)中存在的水分[28-29]。弛豫時間越短，表明對應水分與底物結(jié)合越緊密，水分流動性越低；弛豫時間越長，表明對應水分與底物結(jié)合越松散，水分流動性越強[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)：“注水肉”的T21起峰和峰頂時間顯著早于生鮮肉（P＜0.05），P21顯著大于生鮮肉（P＜0.05），T22峰面積顯著小于生鮮肉（P＞0.05），P22顯著小于生鮮肉（P＜0.05）。這與前人研究[32-34]結(jié)論一致。而生鮮肉和“注水肉”的T23弛豫時間和峰面積比無顯著差異，與王勝威等[35]研究的“注水肉”的T23峰面積顯著增大（P＜0.05）不一致，其原因可能是其研究利用的是向生鮮肉中直接注水后靜置而建立的“注水肉”模型，水分在肉塊中可能多以自由水的形式存在。通常情況下，水的流動性越強，弛豫時間越長，自由水的峰面積增大[30]。本研究則是按照現(xiàn)行違法注水操作，活體灌注后采集的樣品，因而更具有真實性和代表性。相較于單純肌肉注水模型，生豬活體注水后必然會引起機體復雜的代謝、代償反應，同時違法添加物也會影響肌肉組織中水分的流動性，因此導致了本研究中“注水肉”自由水的峰面積比與此前的其他研究不一致。肉的保水性主要取決于肌肉對不易流動水的保持能力。不易流動水主要存在于纖絲、肌原纖維及膜之間。研究顯示，不論是肌肉注射水模型，還是本研究使用的活體注射違法添加劑結(jié)合水分灌注模型，T22弛豫時間均延長，表明注水行為都對肌肉組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了損傷，這一點從HE 染色組織學研究也得到了證實。

對比生鮮肉和“注水肉”的水分含量分布可以發(fā)現(xiàn)，二者水分含量分布區(qū)域基本重疊，不能有效區(qū)分“注水肉”，且“注水肉”的水分含量值基本不超過77%的限量值。對生鮮肉和“注水肉”的水分、蛋白質(zhì)和脂肪的測定結(jié)果表明，生鮮肉和“注水肉”單位質(zhì)量內(nèi)的脂肪和蛋白質(zhì)含量發(fā)生了顯著變化，大大降低了單位肉品中有效營養(yǎng)成分比例[27]。通過含量分布圖發(fā)現(xiàn)：水分和脂肪含量指標分布區(qū)域極度重疊，無法有效區(qū)分生鮮肉和“注水肉”；而蛋白質(zhì)含量和水分/蛋白質(zhì)比值分布差異顯著，可大體區(qū)分兩者。

有資料[36]顯示，在巴西農(nóng)業(yè)畜牧和食品供應部發(fā)布的2010年第32號技術規(guī)范中，不僅對分割雞肉的水分含量和蛋白質(zhì)含量范圍提出了要求，并且對水分/蛋白質(zhì)比值的范圍也提出了明確要求。由此可以看出，水分/蛋白質(zhì)比值已經(jīng)被一些國家和地區(qū)作為評價肉品質(zhì)量的關鍵指標。

本研究以營養(yǎng)成分作為聚類分析項，來鑒別生鮮肉和“注水肉”，發(fā)現(xiàn)以水分/蛋白質(zhì)比值的聚類分析結(jié)果為最優(yōu)，其中“注水肉”的識別率為88.9%，生鮮肉的識別率為96.7%，說明利用水分/蛋白質(zhì)比值能夠較準確鑒別生鮮肉和“注水肉”。但受樣本量的限制，其具體閾值還有待通過大樣本量的測定后加以確定。同時，未來指標閾值的確定可能還要根據(jù)物種、品種、年齡等不同而分別研究確定。本研究利用低場核磁技術，重點分析了二者的水分分布差異以及“注水肉”模型特性，因此僅隨機各選取6個生鮮肉和“注水肉”樣品進行對照分析，而對于所有樣品的檢測分析，待后續(xù)進一步細化研究。

4 結(jié)論

本研究模擬當前違法注水案件所采用的方法建立注水肉模型，從水分、蛋白質(zhì)、脂肪含量以及水分/蛋白質(zhì)比值等判別“注水肉”指標中，篩選出水分/蛋白質(zhì)比值為“注水肉”判別的指征性篩查指標，但需進一步研究確定指標閾值。