山東省中西醫(yī)結合學會超聲專業(yè)委員會

超聲造影技術是現(xiàn)代超聲領域研究的熱點之一，其具有無電離輻射、低成本、可實時成像等優(yōu)勢，還能夠在超聲輻照下產生聲孔效應，使更多治療藥物進入細胞內發(fā)揮作用［1-2］。超聲靶向微泡破壞技術已被用于溶栓治栓、藥物遞送、基因治療、腫瘤耐藥逆轉等臨床領域［3-6］。隨著超聲分子成像技術和生物納米技術的迅猛發(fā)展，納米級超聲造影劑成為近年來分子影像學領域的研究熱點之一，其可有效克服傳統(tǒng)腫瘤藥物治療靶向性差、全身毒副作用大等缺點，具有很強的穿透力，能穿過腫瘤組織血管壁間隙，其開發(fā)和應用還有利于進一步發(fā)展靶向性、高效性、小型化且具有輔助治療作用的新型超聲造影劑。納米級超聲造影劑是超聲分子影像學發(fā)展的重要方向，也是腫瘤靶向性、可視化精準治療及實現(xiàn)診療一體化的新方向［7］。近年來，雖然納米超聲造影劑作為新型靶向給藥系統(tǒng)及實現(xiàn)診療一體化的重要意義已取得共識，但如何制備具有更高生物安全性及穩(wěn)定性的納米超聲造影劑等問題，亟待進一步規(guī)范，為此制定了多功能納米超聲造影劑用于腫瘤分子成像和診療一體化的專家共識，以規(guī)范多功能納米超聲造影劑的制備、安全性評價及診療一體化應用等問題。

1 新型納米級超聲造影劑的制備及表征

為了降低由于制作材料毒性帶來的健康損害和安全隱患，用于組裝超聲納米泡（nanobubbles，NBs）材料的生物相容性、可降解性和安全性至關重要［8-10］。多糖殼聚糖由于其天然來源、生物降解性、生物相容性、極低的免疫原性、抗菌活性及實用性而備受關注［11-13］。本共識中設計的NBs 以天然殼聚糖材料為外殼，加入卵磷脂和棕櫚酸2 種生物安全性高的天然物質作為輔助材料［14-16］。

1.1 負載阿霉素的殼聚糖NBs 的制備 根據先前描述的方法［17-19］，以中等分子量殼聚糖（100～300 kD）作為殼材料，全氟丙烷用作NBs 的核心，制備了新型負載阿霉素（doxorubicin，DOX）的殼聚糖NBs。先將適量DOX 溶解在超純水中，用渦旋混合器混合后，加入到殼聚糖水溶液中。將DOX-殼聚糖溶液放置在65 ℃溫箱內溫育1 h。另將棕櫚酸溶于超純水中，再把含有Epikuron 200 的乙醇溶液加入棕櫚酸溶液里，加入適量超純水，使用渦旋混合器將棕櫚酸-Epikuron 200 系統(tǒng)均化。隨后，將棕櫚酸-Epikuron 200 溶液分裝于數個1.5 mL eppendorf（EP）管中，用10 mL 注射器把EP 管中的空氣替換為全氟丙烷。每個密封EP 管在銀汞調和器中振蕩120 s。在冰浴狀態(tài)下，將EP 管中所有液體依次倒入盛有DOX-殼聚糖溶液的離心管中，輕輕上下晃動離心管混合均勻。最后，將制成的NBs 在4 ℃下溫育30 min。再在玻璃棒輕輕攪拌下將微量Pluronic F68（0.01%，w/w）水溶液作為穩(wěn)定劑加入上述混合液中。以超濾離心方式進行透析提純NBs，除去溶液中殘留的游離DOX 和其他材料。

1.2 DOX-NBs 的物理化學表征 制備的NBs 顯示出球形形態(tài)，在倒置顯微鏡下，呈離散且完整的球形輪廓（圖1a），這與熒光顯微鏡成像一致（圖1b）。DOX-NBs 溶液的代表性透射電子顯微鏡圖像見圖1c。NBs 的物理性質由粒度和zeta 電位分析儀確定。DOX-NB 的平均直徑為641 nm，PI 0.256。DOX-NBs的zeta 電位為（67.12±2.1）mV，足以使它們相互排斥，有助于預防NBs 聚集以維持其長期穩(wěn)定性。

圖1 DOX-NBs 的物理表征 圖1a 光學顯微鏡下觀察到的NBs（放大倍數1 000 倍）圖1b DOX-NBs 的熒光顯微鏡圖像 圖1c DOX-NBs的透射電子顯微鏡圖像

1.3 DOX-NBs 的穩(wěn)定性和載藥效率 DOX-NBs 在室溫4 ℃放置24 h 及48 h，粒徑大小無顯著變化。在25 ℃儲存6 h 后，磷酸鹽緩沖液和人血清中DOX-NBs的粒徑均略增大。使用UV 分光光度計（UV-2450，SHIMADZU）測量DOX 的熒光強度，測得DOX-NBs的最終DOX 負載量為64.12 mg/g DOX-NBs，相當于藥物包封效率為54.18%。

1.4 DOX-NBs 的超聲成像能力及穩(wěn)定性檢測 DOXNBs 的超聲增強顯像效果和穩(wěn)定性用超聲診斷儀GE Logiq E9 進行體外驗證（圖2），結果顯示，DOXNBs 獲得了良好的超聲增強效果；NBs 懸浮液中的超聲衰減過程相對較慢，表明DOX-NBs 的超聲信號可足夠穩(wěn)定以用于成像和對比度增強。

圖2 體外驗證 圖2a 體外實驗裝置圖2b體外實驗裝置分別在0、5、10 和15 min 時DOX-NBs 的超聲增強顯像 圖2c 15 min 內DOX-NBs 的TIC

2 新型納米級超聲造影劑的體內、外安全性評價

2.1 NBs 的細胞毒性測定 使用70%占空比和100 Hz脈沖率的低強度超聲治療儀以1 MHz 的固定頻率對加入不同濃度NBs 的乳腺癌MCF-7 細胞行超聲刺激（表1）［20］。使用八肽膽囊收縮素（CCK-8）試劑盒（Sigma-Aldrich，USA）測試空殼聚糖NBs 的生物安全性。NBs 在一定的超聲強度下幾乎不影響細胞活力。當使用0.5 W/cm2的超聲強度照射30 s 后，在含有10%NBs 懸浮液的培養(yǎng)基中有99.53%的MCF-7 細胞存活；在含有30%NBs 懸浮液的培養(yǎng)基中超過80%的細胞存活（圖3）?？梢姡琈CF-7 細胞活力的降低與NBs 的濃度具有劑量依賴性關系。此外，超聲強度和輻照時間也是影響MCF-7 細胞活力的因素。為保證超聲造影的生物安全性，超聲強度0.5 W/cm2和輻照時間30、60 s 被用于細胞攝取實驗。

圖3 不同濃度的空白NBs 和超聲強度在MCF-7 細胞中的體外細胞毒性

2.2 NBs 的體內安全性評價 選取健康清潔級小鼠按照給藥方式和劑量的不同，隨機分為a～f 共6組，每組10 只（表2）。參照文獻［21-22］，口服時按總劑量2 100 mg/kg 體質量、給藥容積0.8 mL/只，分2 次進行，為當日（8 時、16 時）；腹腔注射時，一次性注入總劑量240 mg/kg 體質量，給藥容積0.5 mL/只；靜脈注射時，小鼠尾靜脈一次性注入總劑量80 mg/kg 體質量，給藥容積0.5 mL/只。陰性對照組給予等量的滅菌蒸餾水作為對照。

表2 實驗小鼠的分組

給藥后觀察小鼠的一般情況，飼養(yǎng)14 d 后檢測小鼠的血生化指標（包括尿素氮、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總蛋白、白蛋白、三酰甘油、膽固醇、血糖等）、各臟器的病理學變化（包括心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟等）。結果顯示，給藥后各組小鼠均未出現(xiàn)死亡、體質量增長情況（表3），組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。靜脈注射組給藥當日部分小鼠出現(xiàn)短暫的站立不穩(wěn)、食欲下降和飲水量增多情況。其余各組及對照組小鼠均未出現(xiàn)異常。各組小鼠血生化指標均在正常范圍；大體標本組織顏色、形態(tài)均未見顯著異常，病理切片各臟器均未見異常改變（均P＞0.05）。

表3 各組小鼠體質量增長情況

3 新型納米級超聲造影劑的靶向遞藥能力

3.1 DOX-NBs 殺傷能力的體外研究 將MCF-7 細胞分6 組：DOX 組；DOX-NBs 組；DOX+超聲1（0.5 W/cm2，30 s）組；DOX-NBs+超聲1 組；DOX+超 聲2（0.5 W/cm2，60 s）組；DOX-NBs+超聲2 組。

3.1.1 體外細胞內藥物攝取 使用流式細胞技術測定DOX 的細胞內攝?。?3］。分別給予刺激后，離心收集細胞，重懸后放置于FACS Calibur 流式細胞儀上分析。在無超聲輻照狀態(tài)下，用DOX-NBs 孵育的MCF-7 細胞的平均熒光強度遠低于用游離DOX 孵育細胞的自發(fā)熒光強度（圖4）。說明在非超聲輻照部位，NBs 能夠減少細胞對其負載藥物的攝取，可通過降低化療藥物的攝取及其誘導的細胞損傷保護機體循環(huán)中的正常組織細胞。在超聲輻照下，DOX-NBs孵育的MCF-7 細胞攝取DOX 顯著增加，說明超聲輻照DOX-NBs 能夠顯著提高MCF-7 細胞對DOX 的攝取率。

3.1.2 DOX-NBs 和超聲輻射介導的體外DOX 遞送及殺傷能力的增強 用CCK-8 細胞毒性試驗定量評估DOX-NBs 及游離DOX 對MCF-7 細胞的殺傷能力［23］，結果顯示，未經超聲輻照時，DOX-NBs 組細胞存活率（21.0%±2.2%）明顯高于游離DOX 組（6.4%±0.7%）（P＜0.01），說明以NBs 作為藥物傳遞載體，能夠顯著改善DOX 在機體循環(huán)中誘導的非病變部位（無輻照部位）的組織細胞損傷。此外，與單獨使用DOXNBs 治療的細胞（21.0%±2.2%）相比，DOX-NBs+超聲組（超聲1 組、超聲2 組）的細胞存活率（3.1%±0.8%，2.2%±0.9%）顯著降低（P＜0.01）。同時，DOXNBs+超聲組（超聲1 組、超聲2 組）的細胞存活率也小于游離DOX 組（6.4%±0.7%）和游離DOX+超聲組（超聲1 組、超聲2 組）（4.1%±0.8%，3.8%±0.6%）（圖5）。結果表明DOX-NBs+超聲顯著增強了DOX在MCF-7 細胞中的細胞毒性作用。

3.2 DOX-NBs 殺傷能力的體內研究 將小鼠分為對照組、DOX 組、DOX+超聲組、DOX-NBs+超聲組、2×DOX-NBs+超聲組，每組7 只，分別在小鼠種瘤后第7 天、第9 天、第11 天進行DOX-NBs 及等濃度的DOX 水溶液局部注射治療，治療劑量為0.1 mL NBs 或相應濃度的DOX 水溶液，第13 天處死各組小鼠，取出腫瘤組織。體質量記錄為種瘤當天測量和治療后處死前測量，比較差值。瘤體變化為種瘤后治療時的大小與處死當天的瘤體大小差異。各組間體質量和瘤體積變化差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。兩兩比較顯示：DOX 組、DOX+超聲組、DOX-NBs+超聲組體質量變化均大于對照組（均P＜0.05），DOXNBs+超聲組體質量變化大于2×DOX-NBs+超聲組（P＜0.05），其他組間體質量變化差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。DOX 組、DOX+超聲組、DOX-NBs+超聲組、2×DOX-NBs+超聲組瘤體積變化明顯小于對照組（均P＜0.05），DOX-NBs+超聲組、2×DOX-NBs+超聲組瘤體積變化小于DOX 組（均P＜0.05），DOXNBs+超聲組瘤體積小于DOX+超聲組（P＜0.05），其他組間瘤體積變化差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（表4）。

圖4 各組MCF-7 細胞攝取DOX 的熒光強度（超聲1 組：超聲強度0.5 W/cm2，輻照時間30 s，超聲2 組：超聲強度0.5 W/cm2、輻照時間60 s）圖5 不同組中MCF-7 細胞活力的比較

表4 各組間體質量和瘤體積變化的比較

綜上所述，本共識制備的負載DOX 的生物相容性殼聚糖NBs，其具有良好的超聲增強顯像能力和極高的生物安全性，并能有效包載DOX，實現(xiàn)靶向遞送及增強其腫瘤殺傷能力。體內外研究結果均證明，DOX-NBs 是一種創(chuàng)新的藥物遞送系統(tǒng)，可用于獲得有效的超聲輔助DOX 遞送，為實現(xiàn)腫瘤診療一體化提供了新思路，為規(guī)范多功能納米超聲造影劑的制備、安全性評價及診療一體化應用等奠定基礎。