王明湖 張孝天 吳國林 蔣琪 施勇烽

（1 寧波市種植業(yè)管理總站，浙江 寧波315012；2 江西財經大學藝術學院，南昌330013；3 中國水稻研究所，杭州310006；第一作者：8227155@qq.com）

農作物品種和種子是農業(yè)生產最重要的物質基礎。隨著《種子法》和《植物新品種保護條例》的頒布實施，我國包括水稻在內的農作物種子產業(yè)得到迅速發(fā)展，種子企業(yè)和品種數量明顯增加，但同時也存在不同程度的品種雷同、侵權等現象。植物新品種測試（DUS測試）可根據品種特異性、一致性和穩(wěn)定性試驗結果判定品種是否屬于新品種，但由于其測試周期較長、工作量大、易受環(huán)境因素影響等原因，導致在實踐中很難及時高效的對大量品種進行鑒定。

研究表明，分子標記以DNA 序列多樣性為基礎，能穩(wěn)定遺傳且可反映品種分子特征，具有高度的專一性和特異性，可應用于品種真實性鑒定、純度鑒定和審定監(jiān)管等多個環(huán)節(jié)。我國已在小麥、玉米、水稻等作物品種中建立了DNA 指紋鑒定技術的檢測標準，并推薦了一批可用于不同作物的核心分子標記。農業(yè)農村部于2007年頒布了《水稻品種鑒定DNA 指紋方法》（NY/T 1433-2007），并于2014年將其修訂為《水稻品種鑒定技術規(guī)程SSR 標記法》（NY/T 1433-2014），在2007年的行業(yè)標準中，推薦的SSR 標記為24 個，在2014年修訂版中標記數增加為48 個，這顯然可大幅提高品種鑒別能力，更加適應目前水稻品種審定監(jiān)管的要求。

寧波地處寧紹平原，為浙江省傳統的單雙季秈粳稻區(qū)和水稻高產區(qū)[1]。2010—2015年，寧波市農業(yè)科學院培育的甬秈15、甬秈69、寧81、寧88 及甬優(yōu)12 等甬優(yōu)系列組合在早稻、常規(guī)晚粳稻和雜交晚粳稻中的累計種植面積遠超其他品種[2]。本研究征集了部分寧波地區(qū)水稻品種，利用行業(yè)標準推薦引物構建34 個品種的指紋圖譜，分析品種間的遺傳相似性，同時利用2 個標記對19 個甬優(yōu)系列雜交稻品種的純度進行了鑒定，以期為水稻品種鑒定行業(yè)標準在寧波地區(qū)生產或培育的品種鑒定應用方面提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

34 個寧波地區(qū)水稻品種用于DNA 指紋圖譜數據庫構建，主要包括甬優(yōu)系列雜交稻組合、常規(guī)早稻品種、常規(guī)晚稻品種及雜交晚秈稻品種，具體為：甬優(yōu)6號、甬優(yōu)8 號、甬優(yōu)9 號、甬優(yōu)10 號、甬優(yōu)15、甬優(yōu)17、甬優(yōu)12、甬優(yōu)362、甬優(yōu)538、甬優(yōu)720、甬優(yōu)1512、甬優(yōu)1540、甬優(yōu)1640、甬優(yōu)2640、秀水134、中早39、嘉育253、嘉育280、秀水09、嘉禾218、甬秈15、甬秈69、寧81、黃華占、紹糯9714、臺糯1 號、甬糯34、揚兩優(yōu)6號、豐優(yōu)22、中浙優(yōu)1 號、秀水519、中浙優(yōu)8 號、中浙優(yōu)10 號、寧88。

表1 53 個SSR 標記的基本信息

19 個甬優(yōu)秈粳雜交品種（甬優(yōu)9 號、甬優(yōu)10 號、甬優(yōu)15、甬優(yōu)17、甬優(yōu)12、甬優(yōu)538、甬優(yōu)1540、甬優(yōu)2640、甬優(yōu)7861、甬優(yōu)1538、甬優(yōu)4149、甬優(yōu)4949、甬優(yōu)59、甬優(yōu)58、甬優(yōu)35、甬優(yōu)51、甬優(yōu)31、甬優(yōu)55、甬優(yōu)50）用于純度鑒定。

1.2 DNA 提取

采用簡易法提取水稻總DNA，用于數據構建的品種每份提取3 個單株，用于純度鑒定的品種每份隨機提取100 個單株。提取的DNA 溶解于50 μL 的1xTE中，儲存于-20℃溫度下。

1.3 SSR 標記及PCR

采用農業(yè)行業(yè)標準NY/T1433-2007 和NY/T1433-2014 推薦的SSR 引物（表1）作為品種鑒定標記，引物由上海生工合成。

PCR 反應總體積10 μL，包含1 μL 的模板DNA、1.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTP、正反向引物各0.5 μmol/L、5xSSR buffer 2 μL 和Taq DNA 聚合酶0.5U。擴增條件為94℃預變性2 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，30 個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR 擴增反應在Biometra T-Grandient PCR 儀中進行。

1.4 電泳檢測

PCR 擴增產物采用北京六一儀器廠生產的DYCZ-24B 型電泳儀，用6.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離和銀染顯色。電泳緩沖液為1XTBE，電泳電壓120V，銀染顯色后記錄帶型。

1.5 數據分析

SSR 標記多態(tài)性信息含量（PIC）按照公式PICi=1-其中Pij表示標記i 的第j 個等位基因在樣本中的分布頻率，n 為標記i 總等位基因數，PIC 值用于反應標記在樣本中檢測的多態(tài)性值。同時，應用軟件NTSYS，以similarity 方法計算相似系數并進行UPGMA聚類分析。

2 結果與分析

2.1 SSR 標記的多態(tài)性

53 對引物在34 份研究材料中共檢測到183 個等位基因，平均每對引物獲得的等位基因數為3.5 個，每個SSR 標記可以檢測到的等位基因數為1～7 個，有49個標記的PIC 在0.3 以上，其中37 個在0.5 以上（表1）。引物RM176 僅檢測到1 個等位基因數，引物RM72、RM219、RM297 則檢測到7 個等位基因數。根據NY/T-1433-2014 推薦引物的分組，發(fā)現I 組平均獲得的等位基因數為4.3 個，II 組為3.2 個，III 組為3.3 個，IV 組為2.8 個。將NY/T-1433-2007 中推薦但NY/T-1433-2014 淘汰的5 個標記歸為V 組，其平均獲得的等位基因數為4.2 個。

表2 利用I 組SSR 標記構建的34 個品種DNA 指紋圖譜

2.2 DNA 指紋圖譜的建立

以53 個標記建立34 份研究材料的DNA 指紋圖譜，表2 為12 個I 組標記獲得的34 份材料DNA 指紋圖譜。每列數據代表某SSR 標記在34 份材料中檢測的帶型的數字化代號，如11 表示檢測出純合1 的等位基因型，22 表示檢測出純合2 的等位基因型，而12 則表示檢測到包含1 和2 的雜合等位基因型，未檢測到任一等位基因型則記為00。這些數字化代號按同樣的順序排列起來就構成了這34 份水稻品種的分子身份證號碼，如甬優(yōu)6 號的I 組分子身份證號碼為441512111111124633112211。筆者發(fā)現，用I 組標記獲得的甬優(yōu)15 和甬優(yōu)17 分子身份證號碼完全相同，這也表明甬優(yōu)15 和甬優(yōu)17 的親緣關系非常近，僅用12個I 組標記無法鑒定兩者的差異，但增加NY/T1433-2014 推薦的另外36 個標記后，則可將甬優(yōu)15 和甬優(yōu)17 區(qū)分開。

2.3 聚類分析

應用53 對SSR 引物檢測34 份供試材料，其遺傳相似性系數的變化范圍為0.13～0.97，平均相似系數為0.50?；诰垲惙治?，建立一個系統樹（圖1），相似系數閾值設為0.50 時，可將上述材料分為2 個類群。類群GI 屬于偏粳稻類型，包括14 個甬優(yōu)系列秈粳雜交稻品種、6 個常規(guī)粳稻品種和3 個糯稻品種，類群GII 則屬于秈稻類型，其中包括6 個常規(guī)秈稻品種和5 個雜交秈稻品種。設相似系數閾值為0.71，又可將類群GI分為GI-I、GI-II 和GI-III 3 個亞群。GI-I 亞群包括甬優(yōu)6 號、甬優(yōu)8 號、甬優(yōu)9 號、甬優(yōu)1512、甬優(yōu)12、甬優(yōu)15、甬優(yōu)17、甬優(yōu)538、甬優(yōu)1640、甬優(yōu)1540 和甬優(yōu)2640。GI-II 亞群包括甬優(yōu)10 號、甬優(yōu)362 和甬優(yōu)720。GI-III 亞群則包括常規(guī)粳稻嘉禾218、秀水09、秀水134、秀水519、寧81、寧88 和臺糯1 號、甬糯34、紹糯9714 等3 個糯稻品種。設相似閾值為0.59，可將類群GII 分為GII-I 和GII-II 亞群。GII-I 亞群包括常規(guī)秈稻品種中早39、嘉育253、嘉育280、甬秈15 和甬秈69，而GII-II 則包括常規(guī)秈稻黃華占和雜交秈稻揚兩優(yōu)6 號、豐優(yōu)22、中浙優(yōu)1 號、中浙優(yōu)8 號、中浙優(yōu)10號。

圖1 34 個品種的SSR 分子聚類圖

圖2 引物RM590 檢測100 粒甬優(yōu)50 的結果

2.4 品種純度分析

引物RM590 在甬優(yōu)10 號中僅擴增出1 個等位基因，其余18 個品種中均擴增出父母本的2 個等位基因，而RM3331 在甬優(yōu)9 號、甬優(yōu)1540、甬優(yōu)2640 等9 個品種中擴增出父母本的2 個等位基因。利用引物RM590 和RM3331 分別對19 個甬優(yōu)系列雜交稻組合進行純度分析。結果表明，100 粒隨機抽取的樣品中，甬優(yōu)50 和甬優(yōu)2640 在2 個標記中均檢測到1 個相同單株的混雜，圖2 為甬優(yōu)50 的100 個隨機單株用RM590 標記檢測的電泳結果。其余17 個品種均未檢測到混雜單株。

3 討論

目前SSR 標記已廣泛應用于水稻品種數據庫構建。程本義等[3]對2002—2006年浙江省98 個主要的水稻品種及2007—2008年155 個浙江省區(qū)試品種進行了DNA 指紋檢測，應用12 個SSR 標記構建了279 個次水稻品種DNA 指紋圖譜數據庫。馬紅勃等[4]用2007 版行業(yè)標準推薦的24 個SSR 標記分析了福建省24 份雜交稻品種和18份雜交稻親本的遺傳多樣性，并建立了42 份材料×12個標記的指紋圖譜。另外，有研究者也利用SSR 標記分析了品種的遺傳多樣性，如羅兵等[5]應用24 個SSR 標記對太湖稻區(qū)現代粳稻品種的遺傳背景進行分析，發(fā)現該區(qū)域種植的粳稻品種背景相似性高，多樣性不夠豐富。

本研究利用SSR 標記對34 份寧波地區(qū)水稻品種進行了遺傳多樣性分析，53 個SSR 標記共檢測到183個等位基因，每個標記可檢測出的等位基因的范圍是1～7 個，平均每個SSR 標記獲得3.5 個等位基因，明顯低于云南陸稻品種的平均等位基因數（8.125）[6]，也低于太湖地區(qū)粳稻品種的平均等位基因數（4.57）[5]，稍高于廣西和廣東優(yōu)質常規(guī)稻的平均等位基因數及黑龍江主栽品種的平均等位基因數[7-8]，這可能與選用的SSR標記及實驗材料的差異有關。

左示敏等[9]利用行業(yè)標準NY/T-1433-2007 和NY/T-1433-2014 中分別推薦的24 個和48 個標記均不能完全將46 份江蘇粳稻相互鑒別開，這既表明江蘇粳稻品種間的遺傳基礎較為狹窄，也說明現有標準并不能完全適用于江蘇粳稻特異性鑒定。林亦霞等[10]在利用標準推薦引物建立94 份雜交稻親本的數字分子指紋庫時，發(fā)現RM176 和RM551 的多態(tài)性不高。本研究同樣發(fā)現，RM176 等部分推薦標記的多態(tài)性不高，對測試品種的鑒別力較弱，在后續(xù)的應用中需要進一步篩選一些多態(tài)性高的SSR 標記，以提高SSR 標記對水稻品種的鑒別力。