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        內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子通過(guò)MeJA介導(dǎo)油樟細(xì)胞揮發(fā)油積累的研究

        2019-12-05 01:25:50嚴(yán)寬,劉杰,魏琴,謝
        福建茶葉 2019年9期
        關(guān)鍵詞:油樟信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)生

        嚴(yán) 寬,劉 杰,魏 琴,謝 浩

        (1.宜賓學(xué)院川茶學(xué)院;2.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,宜賓 644000)

        油樟[Cinnamomum longepaniculatum(Gamble)N.Chao]主要分布于四川省,其莖、葉等器官可以煉取大量精油,主要為萜類(lèi)化合物,包含了1,8-桉葉油素、α-松油醇、γ-松油烯等化學(xué)物質(zhì)。油樟精油具有一定的功效性,包括消炎、殺菌和抗氧化等作用。植物內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)植物的次生代謝是通過(guò)特定的信號(hào)分子和其相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的。隨著對(duì)信號(hào)分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的深入研究,發(fā)現(xiàn)在許多植物體中MeJA都發(fā)揮著重要的信號(hào)分子作用[1]。在施加外源MeJA時(shí),可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御機(jī)制,誘發(fā)多種次生代謝產(chǎn)物的生成[2]。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子促進(jìn)油樟懸浮細(xì)胞產(chǎn)生揮發(fā)油合成過(guò)程中MeJA作用的研究,來(lái)探討內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子與油樟懸浮細(xì)胞揮發(fā)油合成過(guò)程中的MeJA信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,以便在未來(lái)關(guān)于油樟細(xì)胞中次級(jí)代謝的調(diào)控規(guī)律能夠有更深入的了解,從而可以找到提高調(diào)控油樟細(xì)胞揮發(fā)油產(chǎn)量的方法。

        1 方法與材料

        1.1 材料來(lái)源與處理

        從宜賓紅巖山油樟基地(位于27°50'N;105°20'E)采集了油樟葉的樣本。內(nèi)生真菌(Penicillium commune,2J1)從油樟植物中分離出來(lái),將這些真菌培養(yǎng)并保存在PDA培養(yǎng)基內(nèi)。

        1.2 建立油樟細(xì)胞懸浮體系

        選用生長(zhǎng)良好的油樟幼嫩葉片培養(yǎng)愈傷組織后,繼代培養(yǎng)2-3次。之后選取色澤鮮亮、長(zhǎng)勢(shì)良好,質(zhì)地疏松的嫩黃色愈傷組織,約2.0g/瓶,25℃,遮光,振蕩培養(yǎng)(120 r·min-1)。每隔7 d繼代一次,連續(xù)繼代2-3次[3]。

        1.3 內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子的制備

        將一株青霉菌屬(Penicilliumsp.)的內(nèi)生真菌接種到配置好的PDA液體培養(yǎng)基中,在28℃,130r/min的震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d,之后將2J1的菌體與發(fā)酵液進(jìn)行分離,將內(nèi)生真菌2J1的菌體破碎成勻漿之后與發(fā)酵液混合,進(jìn)行減壓抽濾,最后在高溫高壓滅菌鍋中121℃滅菌20min,便可得到內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子。采用蒽酮-硫酸法測(cè)定誘導(dǎo)子糖含量[4]。

        1.4 油樟懸浮細(xì)胞揮發(fā)油的提取與測(cè)定

        精確稱(chēng)取烘干之后的油樟細(xì)胞0.3g,加入環(huán)己烷冷浸過(guò)夜(環(huán)己烷與細(xì)胞的比例為4:1),隨后進(jìn)行30min的超聲提取,在5000r/min的超速離心機(jī)上離心4min,提取上清液,定容到5mL。用針筒抽取液體,濾膜過(guò)濾至上樣瓶中,測(cè)定揮發(fā)油的含量,用GC-MS分析[5]。1,8-桉葉油素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y=73900X-299200,R2=0.9993。

        1.5 油樟懸浮細(xì)胞中MeJA含量的測(cè)定

        油樟懸浮細(xì)胞中MeJA含量采用頂空固相微萃取技術(shù)測(cè)定[14]。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):y=7676.9x+6234.5 R2=0.9985

        1.6 數(shù)據(jù)軟件及處理

        揮發(fā)油的產(chǎn)量和實(shí)驗(yàn)處理使用三次重復(fù)測(cè)量。所有相關(guān)數(shù)據(jù)采用SPSS進(jìn)行路徑系數(shù)分析統(tǒng)計(jì)19.0和Excel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子對(duì)油樟懸浮細(xì)胞MeJA釋放量和揮發(fā)油積累的影響

        在培養(yǎng)7d的油樟懸浮細(xì)胞中加入內(nèi)生真菌2J1粗誘導(dǎo)子40mg/L,以加入等量的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照組。考察2J1誘導(dǎo)子對(duì)油樟懸浮細(xì)胞內(nèi)MeJA含量和揮發(fā)油積累的影響。經(jīng)過(guò)油樟內(nèi)生真菌2J1處理后的油樟懸浮細(xì)胞,培養(yǎng)至第21d時(shí)誘導(dǎo)效果最好,產(chǎn)生的揮發(fā)油含量較高;但是誘導(dǎo)的時(shí)間過(guò)長(zhǎng),油樟懸浮細(xì)胞揮發(fā)油產(chǎn)量反而有所減少。

        2.2 MeJA釋放和揮發(fā)油積累與不同油樟內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子濃度的關(guān)系

        分別向培養(yǎng)了7d的油樟懸浮細(xì)胞中加入濃度為0mg/L、20mg/L、40 mg/L、60mg/L、80mg/L的內(nèi)生真菌2J1粗誘導(dǎo)子,在油樟懸浮細(xì)胞分別培養(yǎng)21h和14d后檢測(cè)不同濃度誘導(dǎo)子對(duì)油樟懸浮細(xì)胞產(chǎn)生的MeJA釋放和揮發(fā)油的積累的影響。

        2.3 MeJA對(duì)內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子促進(jìn)油樟懸浮細(xì)胞揮發(fā)油合成的影響

        為了更好的了解內(nèi)生真菌2J1粗誘導(dǎo)子通過(guò)化學(xué)信號(hào)MeJA誘導(dǎo)促進(jìn)油樟懸浮細(xì)胞產(chǎn)生揮發(fā)油的作用機(jī)制,在油樟懸浮細(xì)胞培養(yǎng)到7d后進(jìn)行了如下處理,設(shè)置了如下圖中的對(duì)照試驗(yàn),通過(guò)檢測(cè)其中各組中油樟懸浮細(xì)胞MeJA(圖1)和揮發(fā)油的合成情況(圖2)進(jìn)行分析研究,其中內(nèi)生真菌2J1粗誘導(dǎo)子、SHAM、外源MeJA的添加濃度分別為40 mg/L、2mmol/L、100μmol/L。檢測(cè)油樟懸浮細(xì)胞MeJA釋放量的時(shí)間為處理后21h,檢測(cè)油樟懸浮細(xì)胞揮發(fā)油的合成時(shí)間為處理后14d。

        結(jié)果表明,添加外源MeJA可以促使油樟細(xì)胞中的揮發(fā)油合成。而SHAM則可抑制細(xì)胞中MeJA的積累,并導(dǎo)致?lián)]發(fā)油產(chǎn)量的降低。但是,添加SHAM沒(méi)有使內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的油樟細(xì)胞揮發(fā)油的合成量削減完全,因此在油樟懸浮細(xì)胞中可能存在由MeJA作為信號(hào)分子的調(diào)控?fù)]發(fā)油合成的信號(hào)途徑。

        3 討論

        由于內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子屬于細(xì)胞外的物質(zhì)不能直接進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用,所以需要依靠植物細(xì)胞膜外的特異性受體,當(dāng)它與細(xì)胞膜上受體結(jié)合后,便會(huì)使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,產(chǎn)生出一些特定的胞內(nèi)信使物質(zhì),這些信使物質(zhì)可以通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的調(diào)控作用,使植物細(xì)胞中的防御性次生代謝系得以激活,進(jìn)而可以使植物次生代謝產(chǎn)物合成增加[6]。因此,MeJA的迸發(fā)可能是經(jīng)2J1粗誘導(dǎo)子處理后出現(xiàn)的前期反應(yīng),MeJA可能屬于胞內(nèi)的一種信使物質(zhì),經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的生化反應(yīng),成功誘導(dǎo)了油樟細(xì)胞中揮發(fā)油產(chǎn)量的提升。本研究雖然對(duì)MeJA介導(dǎo)內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子對(duì)油樟揮發(fā)油合成的調(diào)控機(jī)制做了進(jìn)一步研究。因此為了能夠使誘導(dǎo)子充分的發(fā)揮其誘導(dǎo)作用,關(guān)于內(nèi)生真菌2J1粗誘導(dǎo)子的純度和結(jié)構(gòu)有必要做進(jìn)一步的純化和檢測(cè),以此來(lái)研究誘導(dǎo)子更好的制備和保存方法[7]。由此實(shí)驗(yàn)還可以推測(cè)出存在著其他途徑引起油樟細(xì)胞中揮發(fā)油的合成與積累。植物次生代謝產(chǎn)物的合成途徑是非常復(fù)雜的,可能還存在其他的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,這仍需進(jìn)一步的研究。

        圖1 各組中MeJA的累積情況

        圖2 各組中揮發(fā)油的累積情況

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