姚 斌，洪曉雅2*，尚福泰2，惠亮亮，安旭生

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院 1.重癥醫(yī)學(xué)科,2.麻醉科,江蘇 淮安 223300)

手術(shù)腦受損(SBI)是指在實(shí)施神經(jīng)外科手術(shù)過程中導(dǎo)致非疾病本身引成的神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)[1]。人們的正常機(jī)體內(nèi)存在一些微量的抗腦抗體，但是當(dāng)SBI破壞血腦屏障時，會釋放出大量的腦抗原進(jìn)入血液，刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的腦抗體，激活免疫系統(tǒng)引起繼發(fā)反應(yīng)導(dǎo)致腦水腫、血腦屏障破壞及神經(jīng)元死亡，進(jìn)一步加重腦損傷[2]。目前臨床上治療繼發(fā)性炎癥反應(yīng)比較新穎的方式是針對抗原特異性的誘導(dǎo)免疫耐受治療方法[3]。胸腺是一個對于T淋巴細(xì)胞非常重要的場所。T淋巴細(xì)胞在其經(jīng)歷分化、發(fā)育和成熟階段，它可以經(jīng)過陰性選擇獲得自身免疫耐受特性，而胸腺表達(dá)的內(nèi)源性蛋白質(zhì)也會經(jīng)過抗原提呈細(xì)胞提呈給淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)中樞免疫耐受[4]。髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中僅次于蛋白脂蛋白之后含量第二豐富的蛋白質(zhì)，但是在胸腺中并不表達(dá)[5]。所以本文擬在大鼠胸腺內(nèi)注射MBP誘導(dǎo)免疫耐受，觀察其能否減輕SBI引起的腦神經(jīng)功能缺陷和腦水腫。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取SD大鼠30只，體重260～300 g，雌雄各半，購自蘇州工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司，許可證號：SDK(蘇)2009-0001；飼養(yǎng)室溫22～25 ℃，濕度35%～50%，自由攝食及飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和MBP處理組，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠SBI模型制備 經(jīng)腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉后備皮，安裝立體定向儀，頭部消毒。無菌條件下，正中矢狀位切開頭皮，暴露顱骨，于矢狀縫右側(cè)2 mm、冠狀縫后1 mm處開直徑4 mm骨窗，尖刀切開硬腦膜后銳性切除大小2 mm×3 mm ×3 mm腦組織，止血后逐層縫合，隨后，大鼠取仰臥位，無菌條件下沿頸部正中切開皮膚和皮下組織，仔細(xì)分離肌肉，沿胸部正中剪開胸骨柄，暴露胸腺。在直視下，模型組和MBP處理組分別每側(cè)胸腺注射50 μL等滲鹽水和MBP(1 mg/mL)。止血后逐層縫合皮下組織和皮膚[6]。

假手術(shù)組：照同樣方法開骨窗，但保持硬腦膜完整，暴露胸腺只進(jìn)行空針穿刺，未注射任何物質(zhì)。

1.2.2 大鼠神經(jīng)系統(tǒng)行為評價 造模后的1天、7天和14天,對大鼠進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)行為評價(MNSS)，評分包括5個方面：提尾反射(0～3分)、行走測試(0～3分)、感覺測試(0～2分)、平衡測試(0～6分)、反射缺失和反常運(yùn)動(0～4分)，大鼠缺失1項(xiàng)反射或不能完成測試即計(jì)相應(yīng)分?jǐn)?shù)，分?jǐn)?shù)越高，損傷越重。

1.2.3 大鼠腦水腫體積檢測 造模后的1、7和14天，對大鼠行頭部MRI掃描，并利用交互式分割算法分割每個斷面，獲得每個斷層圖像的邊緣，計(jì)算每個截面的面積并乘以該斷層厚度即可獲得水腫部分體積。

1.2.4 血清炎性因子檢測 造模術(shù)后1、3、7、14、21天心臟穿刺取血800 μL，分離血清-80 ℃保存，ELISA法檢測IL-1、IL-2和TGF-β濃度。

1.2.5 PCR檢測 (1)組織總RNA提?。河肨RIzol試劑盒提取勻漿后的腦組織的RNA(按照說明步驟進(jìn)行)，然后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，并保存在-70℃冰箱備用；(2)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：以O(shè)ligo(dT)18為引物，反應(yīng)體積2 μL，補(bǔ)DEPC處理的水至終體積25 μL，按說明操作。-20 ℃凍存；(3)PCR擴(kuò)增，上游引物為5′-GGAATGGGAAGACACATATGGAACTGC-3′，下游引物5′-CATATCTGGCCAGTAGTGCAGTAATTC-3′，25 u12xSYBR GREEN MIX和cDNA2 μL，200 μmol上下游引物,補(bǔ)ddH20至50 μL，然后以50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min的反應(yīng)條件，進(jìn)行50個循環(huán)(95 ℃ 15 s，退火溫度30 s，72 ℃ 30 s)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠MNSS評分比較

三組隨時間延長，MNSS評分有所降低；模型組和MBP處理組處理后7d、14d MNSS評分明顯高于假手術(shù)組，其中MBP處理組處理后7天、14天 MNSS評分明顯低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠MNSS評分比較

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05(n=10).

2.2 各組大鼠腦水腫體積比較

模型組和MBP處理組處理后7天腦水腫體積達(dá)到高峰；模型組和MBP處理組處理后1、7、14天腦水腫體積明顯高于假手術(shù)組，其中MBP處理組處理后1、7、14天腦水腫體積明顯低于模型組。見表2。

2.3 各組血清IL-1、IL-2和TGF-β水平

模型組和MBP處理組隨時間延長，IL-1、IL-2和TGF-β水平有所降低；模型組和MBP處理組處理后1、7、14天，IL-1、IL-2和TGF-β水平明顯高于假手術(shù)組，其中MBP處理組處理后1、7、14天，IL-1、IL-2和TGF-β水平明顯低于模型組。見表3～5。

表2 各組大鼠腦水腫體積比較 (mm2)

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05.

表3 各組血清IL-1水平比較 (pg/mL)

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05(n=10).

表4 血清TGF-β水平 (pg/mL)

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05(n=10).

表5 血清IL-2水平 (pg/mL)

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05(n=10).

2.4 各組腦組織FasL mRNA表達(dá)

MBP處理組腦組織FasL mRNA相對表達(dá)量為(0.876±0.112)，明顯高于假手術(shù)組和模型組。見表6。

表6 各組腦組織FasL mRNA表達(dá)

與假手術(shù)組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05(n=10).

3 討 論

開顱手術(shù)一般都會有較大的創(chuàng)口，由此會導(dǎo)致免疫細(xì)胞攻擊一些暴露出的具有免疫耐受的神經(jīng)組織，繼而激活小膠質(zhì)細(xì)胞，并釋放一些炎性因子[7]。此外腦組織中的部分蛋白和血液中的淋巴細(xì)胞會由于血腦屏障的破壞而互相交換地方，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在抗原與免疫細(xì)胞的接觸誘導(dǎo)下會向TH1細(xì)胞轉(zhuǎn)化[8]。巨噬細(xì)胞會被炎癥因子誘導(dǎo)游動到損傷組織周圍釋放炎癥因子，進(jìn)一步造成機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，加重腦損傷。MBP是一種強(qiáng)堿性膜蛋白，由脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)(CNS和PNS)的細(xì)胞合成的[9]。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損害，血腦屏障遭到破壞時，血清中的MBP含量就會明顯增高，有研究[10]證明，MBP可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生自身免疫疾病，還能自主免疫保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，所以MBP能減輕腦損傷帶來的危害。

MNSS評分是評價神經(jīng)功能的重要方式，其分?jǐn)?shù)越高，說明神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)通過對各組大鼠進(jìn)行MNSS評分，我們發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，各組的MNSS評分都明顯的下降，且三組MNSS評分由高到低依次為模型組、MBP處理組和假手術(shù)組，說明三組大鼠都有一定的神經(jīng)缺陷，但是對于腦損傷的大鼠來說，注射MBP可以改善神經(jīng)缺陷。MRI檢測腦水腫體積可以反映SBI后神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度及恢復(fù)程度，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看出，模型組和MBP處理組處理后7天腦水腫體積達(dá)到高峰，且三組腦水腫的程度由高到低依次是模型組、MBP處理組和假手術(shù)組，也進(jìn)一步說明了MBP具有降低神經(jīng)損傷、利于恢復(fù)的作用[11]。IL-1是一種細(xì)胞因子，是當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染時由單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生的，集落刺激因子、血小板生長因子等細(xì)胞因子可以在IL-1的刺激下分泌增加，參與免疫應(yīng)答和組織修復(fù)[12]。IL-2主要是由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要的促炎因子，它可以趨化CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞到達(dá)損傷部位建立器官特異性的免疫反應(yīng)。TGF-β即轉(zhuǎn)化生長因子，它屬于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的TGF-β超家族，對細(xì)胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用，可以在同種異體移植耐受或自身免疫耐受中起到作用[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨時間延長，MBP處理組較模型組IL-1、IL-2和TGF-β水平有所降低，說明向胸腺注射MBI可以減輕炎癥反應(yīng)。介導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞調(diào)亡的途徑有多種，而Fas/Fasl的相互作用介導(dǎo)途徑就是其中之一[14]。它在胸腺選擇、免疫豁免等許多重要的生理過程發(fā)揮著重要的作用。其主要在CD4+CD8+早期階段介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，經(jīng)過陰性選擇后的胸腺細(xì)胞可以清除自身反應(yīng)性細(xì)胞來獲得中樞免疫耐受，并經(jīng)自分泌方式誘導(dǎo)T細(xì)胞自身凋亡維持外周細(xì)胞免疫耐受。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MBP處理組的FaslmRNA明顯的高于模型組和假手術(shù)組，說明胸腺注射MBP可以術(shù)后Fasl的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)免疫耐受[15]。

綜上所述，大鼠胸腺內(nèi)注射MBP誘導(dǎo)免疫耐受可以減輕SBI引起的腦神經(jīng)功能缺陷和腦水腫，并且降低炎癥反應(yīng)發(fā)生的概率。