(文昌市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，海南 文昌 571300)

鼻咽癌發(fā)病率位居耳鼻喉惡性腫瘤首位，多發(fā)于東南亞，我國廣東、湖南等省份為高發(fā)地區(qū)[1]。放療是目前臨床治療鼻咽癌的首選方案，對部分病情嚴(yán)重者常聯(lián)用化療[2]。隨著近年來腫瘤治療水平的不斷提升，鼻咽癌患者五年生存率也超過了80%，但繼續(xù)上升的難度增加，其中對鉑類化療藥物的敏感性較差是其中一個主要原因[3]。線粒體肌酸激酶1A(Recombinant Creatine Kinase,Mitochondrial 1A ，CKMT1A)是存在于線粒體膜表面，與細(xì)胞內(nèi)能量傳遞、ATP再生直接相關(guān)的重要激酶，廣泛存在于胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤[4]，但在不同類型腫瘤中的作用存在差異。相關(guān)研究顯示，CKMT1A高表達(dá)與胃癌、結(jié)直腸癌的惡性程度呈正相關(guān)[5]；但與乳腺癌的惡性程度呈負(fù)相關(guān)[6]。目前關(guān)于CKMT1A在鼻咽癌中的作用仍鮮有報(bào)道。順鉑是鼻咽癌患者最常用的鉑類化療藥物之一。人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1能夠敏感地反應(yīng)出在人體中鼻咽癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，被廣泛用于鼻咽癌相關(guān)的體外研究[7-8]。通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低濃度順鉑作用人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1可上調(diào)CKMT1A mRNA表達(dá)，但高濃度順鉑則發(fā)揮相反作用[9]。因此，可推測CKMT1A表達(dá)水平可能與鼻咽癌鉑類化療藥物敏感性有關(guān)。本研究通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)對人鼻咽癌細(xì)胞行CKMT1A過表達(dá)，探討對順鉑敏感性的變化，旨在為提升鼻咽癌鉑類化療藥物化療敏感性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1購于上海博麥德生物技術(shù)有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于杭州仟諾生物科技有限公司?？蛰d體質(zhì)粒pCMV-Neo-Bam、CKMT1A過表達(dá)載體質(zhì)粒購于上海百研生物科技有限公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購于上海雅吉生物科技有限公司；小鼠抗人CKMT1A、c-PARP、BCL2、STAT3、p-STAT3單克隆抗體，兔抗人Bax單克隆抗體購于上海北諾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 使用DMEM完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HONE1細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)，更換成無血清的DMEM培養(yǎng)基，在6孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體為：分別將空載體質(zhì)粒(空載體對照組)、CKMT1A過表達(dá)載體質(zhì)粒(CKMT1A過表達(dá)組)加入含200 μL HEPES緩沖鹽溶液的EP管中，再加入150 μL PEI混合均勻，室溫靜置20 min，將混合液加入HONE1細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，常規(guī)培養(yǎng)6 h后更換DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測順鉑對兩組細(xì)胞生長的抑制情況 取兩組對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105/mL，胰酶消化，用DMEM完全培養(yǎng)重懸，制成細(xì)胞懸液，按150 μL每孔接種于96孔培養(yǎng)板上，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至約80%融合，更換成無血清的DMEM培養(yǎng)基，加入梯度濃度的順鉑，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)終止前4 h每孔加入終濃度為5 mg/mL的MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。檢測前棄去上清，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩5 min，在570 nm處檢測各孔的吸光度(OD)值，使用酶標(biāo)儀自帶系統(tǒng)計(jì)算IC50。

1.2.3 細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測 使用75%的乙醇溶液重懸細(xì)胞，-20 ℃過夜，磷酸緩沖液洗滌后，滴加終濃度為0.2 μg/μL核糖核酸酶，37 ℃靜置30 min，滴加終濃度為50 μg/mL碘化丙啶染色液，4 ℃反應(yīng)10 min，上流式細(xì)胞儀檢測各周期細(xì)胞比例。使用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況，操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA。CKMT1A及內(nèi)參β-actin引物合成由蘇州泓迅生物科技股份有限公司完成，CKMT1A引物序列：上游5′-GTCAGACCTATGTGACTAGATCGCA-3′，下游5′-CAGGAGATCTCAGT CTTGACCGG-3′；β-actin引物序列：上游5′-CCTAGCCGTTTCCGCTCC-3′，下游5′-CTGACTGATGGAGTACTTCTAGG-3′。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)，延伸72 ℃ 60 s。擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，通過CKMT1A目標(biāo)條帶與內(nèi)參β-actin的比值計(jì)算得到CKMT1A mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.5 Western blot檢測 RIPA提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量，行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，滴加一抗：小鼠抗人CKMT1A單克隆抗體(1∶500)，小鼠抗人c-PARP、BCL-2單克隆抗體(1∶200)，兔抗人Bax單克隆抗體(1∶400)，小鼠抗人STAT3、p-STAT3單克隆抗體(1∶500)，4 ℃過夜，滴加HRP標(biāo)記的二抗，室溫反應(yīng)1～2 h，滴加ECL顯色液，避光顯影，以β-actin為內(nèi)參對照計(jì)算各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS20.0軟件分析，劑量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分比(%)表示，組間比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 過表達(dá)CKMT1A人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1建立及鑒定

分別使用濃度為0、2、4、8、16 μmol/L的順鉑處理HONE1細(xì)胞6 h后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示，在低濃度順鉑(0、2、4 μmol/L)作用下，CKMT1A mRNA表達(dá)水平上升，分別為(1.05±0.02)、(1.68±0.06)、(1.71±0.08)；高濃度順鉑(8、16 μmol/L)作用下，CKMT1A mRNA表達(dá)水平下降，分別為(0.73±0.05)、(0.15±0.03)?？赏茰yCKMT1A表達(dá)水平可能與HONE1細(xì)胞對順鉑的敏感性有關(guān)。因自然條件下CKMT1A在HONE1細(xì)胞中的表達(dá)水平較低，因此本實(shí)驗(yàn)使用pCMV-Neo-Bam-CKMT1A質(zhì)粒對HONE1細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)，轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下觀察顯示CKMT1A表達(dá)水平明顯提升，轉(zhuǎn)染率為86%；進(jìn)一步行Western blot檢測顯示，CKMT1A過表達(dá)組CKMT1A蛋白相對表達(dá)量為(4.18±0.72)，明顯高于空載體質(zhì)粒組的(1.24±0.31)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1，圖2。

圖1 pCMV-Neo-Bam-CKMT1A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后熒光顯微鏡觀察(200×)A轉(zhuǎn)染前；B轉(zhuǎn)染前后

圖2 Western blot檢測兩組細(xì)胞中CKMT1A蛋白的表達(dá)1：空載體對照組；2：CKMT1A過表達(dá)組

2.2 不同濃度順鉑對兩組細(xì)胞的生長抑制情況

向兩組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入梯度濃度的順鉑，濃度范圍0～16 μmol/L，MTT法檢測細(xì)胞生長情況顯示，隨著順鉑濃度的增加，兩組吸光度值均呈下降趨勢，其中CKMT1A過表達(dá)組下降幅度更明顯；計(jì)算CKMT1A過表達(dá)組IC50為2.85 μmol/L，明顯低于空載體對照組的4.51 μmol/L(P<0.01，表1)。

表1 不同濃度順鉑對兩組細(xì)胞的生長抑制情況(OD值)

2.3 各周期細(xì)胞比例分布情況比較

空載體對照組與CKMT1A過表達(dá)組各周期細(xì)胞比例分布情況之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；根據(jù)順鉑IC50結(jié)果選取2 μmol/L順鉑處理細(xì)胞24 h后，兩組細(xì)胞均表現(xiàn)為G0/G1期比例明顯下降，S期和G2/M期比例明顯增多，其中CKMT1A過表達(dá)組與空載體對照組相比變化更明顯(P<0.01)。見表2。

2.4 細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

2 μmol/L順鉑處理細(xì)胞48 h后，CKMT1A過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率為(19.47±0.75)%，明顯高于空載體對照組的(10.92±0.86)%(P<0.01)。Western blot檢測顯示，空載體對照組與CKMT1A過表達(dá)組c-PARP、Bax、BCL-2蛋白相對表達(dá)量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2 μmol/L順鉑處理細(xì)胞48 h后，兩組細(xì)胞中c-PARP、Bax相對表達(dá)量明顯升高，BCL-2相對表達(dá)量明顯下降(P<0.05)；其中CKMT1A過表達(dá)+2 μmol/L順鉑組c-PARP、Bax相對表達(dá)量明顯高于空載體對照+2 μmol/L順鉑組，BCL-2相對表達(dá)量明顯低于空載體對照+2 μmol/L順鉑組(P<0.05)。見圖3，表3。

表2 各周期細(xì)胞比例分布情況 (%)

與空載體對照組比較，aP<0.05；與CKMT1A過表達(dá)組比較，bP<0.05；與空載體對照+2 μmol/L順鉑比較，cP<0.05

圖3 凋亡相關(guān)蛋白在各組細(xì)胞中表達(dá)的Western blot電泳條帶1：空載體對照組；2：空載體對照+2 μmol/L順鉑；3：CKMT1A過表達(dá)組；4：CKMT1A過表達(dá)+2 μmol/L順鉑

組別c-PARPBaxBCL-2空載體對照組1.03±0.070.26±0.045.79±0.61CKMT1A過表達(dá)組1.19±0.090.29±0.045.82±0.55空載體對照+2 μmol/L順鉑1.88±0.24a0.52±0.08a7.14±0.20aCKMT1A過表達(dá)+2 μmol/L順鉑3.35±0.30bc0.75±0.11bc0.97±0.17bc

與空載體對照組比較，aP<0.05；與CKMT1A過表達(dá)組比較，bP<0.05；與空載體對照+2 μmol/L順鉑比較，cP<0.05

2.5 各組細(xì)胞STAT3磷酸化水平比較

空載體對照組與CKMT1A過表達(dá)組p-STAT3、STAT3蛋白相對表達(dá)量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)查詢相關(guān)文獻(xiàn)顯示，STAT3磷酸化多發(fā)生于藥物誘導(dǎo)6 h[8]，因此本研究使用2 μmol/L順鉑處理細(xì)胞6 h后，空載體對照+2 μmol/L順鉑組p-STAT3相對表達(dá)量明顯高于空載體對照組，CKMT1A過表達(dá)+2 μmol/L順鉑p-STAT3相對表達(dá)量明顯低于CKMT1A過表達(dá)組(P<0.05)；其中CKMT1A過表達(dá)+2 μmol/L順鉑組p-STAT3相對表達(dá)量明顯低于空載體對照+2 μmol/L順鉑組(P<0.01)。見圖4，表4。

圖4 凋亡相關(guān)蛋白在各組細(xì)胞中表達(dá)的Western blot電泳條帶1：空載體對照組；2：空載體對照+2μmol/L順鉑；3：CKMT1A過表達(dá)組；4 ：CKMT1A過表達(dá)+2 μmol/L順鉑

組別p-STAT3STAT3空載體對照組0.09±0.022.96±0.32CKMT1A過表達(dá)組0.11±0.023.07±0.30空載體對照+2 μmol/L順鉑0.74±0.09a3.11±0.36CKMT1A過表達(dá)+2 μmol/L順鉑0.02±0.01bc3.02±0.28

與空載體對照組比較，aP<0.05；與CKMT1A過表達(dá)組比較，bP<0.05；與空載體對照+2 μmol/L順鉑比較，cP<0.01

3 討 論

鼻咽癌患者的臨床治療中，放射治療是首選方案，對于晚期、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的患者常聯(lián)合化療[8]。鉑類藥物被廣泛用于多種實(shí)體腫瘤的治療，其中順鉑對鼻咽癌具有較好的療效，但隨著療程的延長，多數(shù)患者會出現(xiàn)對順鉑的耐藥性，是導(dǎo)致病情復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移的主要原因之一[9]。因此，探索鉑類化療藥物的抵抗機(jī)制具有重要意義。線粒體具有氧化磷酸化、儲存鈣離子、傳遞電子等多種生理學(xué)作用，可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]。CKMT1A是細(xì)胞凋亡和線粒體氧化磷酸化的主要分子之一，廣泛存在于胃癌、肝癌、肺癌等腫瘤組織中，其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)展明顯相關(guān)，但CKMT1A在鼻咽癌組織和細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)研究仍十分少見。本研究通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在人鼻咽癌細(xì)胞株HONE1中高表達(dá)CKMT1A，旨在探討CKMT1A與人鼻咽癌細(xì)胞對順鉑敏感性的關(guān)系。

本研究顯示，隨著順鉑給藥濃度的增加，空載體對照組與CKMT1A過表達(dá)組的人鼻咽癌細(xì)胞生長均明顯受限，說明鉑類化療藥物順鉑對人鼻咽癌細(xì)胞具有明顯的藥效學(xué)作用，其中CKMT1A過表達(dá)組的人鼻咽癌細(xì)胞生長受限程度更明顯，IC50明顯低于空載體對照組，提示CKMT1A高表達(dá)提升了人鼻咽癌細(xì)胞對鉑類化療藥物的敏感性。細(xì)胞周期檢測顯示，CKMT1A過表達(dá)可明顯促進(jìn)經(jīng)順鉑處理的人鼻咽癌細(xì)胞在G2/M期的阻滯，有利于促進(jìn)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步通過細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2 μmol/L順鉑處理48 h后，CKMT1A過表達(dá)組人鼻咽癌細(xì)胞凋亡率明顯高于空載體對照組，且c-PARP、Bax蛋白表達(dá)水平明顯增加，相關(guān)研究顯示，BCL-2蛋白表達(dá)水平明顯下降。PARP在細(xì)胞DNA修復(fù)和基因穩(wěn)定方面具有重要調(diào)控作用，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，在DNA損傷或應(yīng)激狀態(tài)可激活生成c-PARP，c-PARP在修復(fù)損傷基因的過程中消耗細(xì)胞中大量ATP，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]，同時(shí)c-PARP能夠刺激線粒體分泌凋亡誘導(dǎo)因子，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。促凋亡蛋白Bax的基因組可編碼一種BCL-2家族的前凋亡蛋白，作為線粒體表面的細(xì)胞刺激和損傷傳感器，能夠破壞抗凋亡蛋白BCL-2的正常生理功能[13]。本研究中CKMT1A過表達(dá)可促進(jìn)順鉑處理后的人鼻咽癌細(xì)胞中c-PARP、Bax蛋白表達(dá)，抑制BCL-2蛋白表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮促人鼻咽癌細(xì)胞凋亡的作用。

STAT蛋白是一類存在于細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子，受生長因子、細(xì)胞因子刺激后可被激活，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控基因表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡[14]。STAT3是近年來發(fā)現(xiàn)的STAT蛋白家族新成員，激活后的p-STAT3調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的生長和凋亡[15]。為進(jìn)一步探究CKMT1A過表達(dá)在促進(jìn)人鼻咽癌細(xì)胞對順鉑化療敏感性的分子機(jī)制，本研究檢測了順鉑處理6 h后人鼻咽癌細(xì)胞中STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，CKMT1A過表達(dá)+2 μmol/L順鉑p-STAT3相對表達(dá)量明顯低于CKMT1A過表達(dá)組，而空載體對照+2 μmol/L順鉑組p-STAT3相對表達(dá)量明顯高于空載體對照組，提示過表達(dá)CKMT1A可通過相關(guān)分子機(jī)制下調(diào)STAT3磷酸化水平，抑制靶基因表達(dá)，提升人鼻咽癌細(xì)胞對鉑類化療藥物的敏感性，與上述相關(guān)研究結(jié)論一致。