仇書興 殷星 蘇淑娟 殷俊磊 張家友 劉雪賀 賈坤義 楊曉明

（1. 新鄉(xiāng)學院醫(yī)學院，新鄉(xiāng) 453003；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng) 453003；3. 國藥集團中國生物技術股份有限公司，北京 100000）

2013 年3 月，中國首次報道人感染新型H7N9禽流感病毒病例，引起嚴重甚至致命呼吸道疾病。隨后，疫情迅速席卷中國大陸20 多個省、市、自治區(qū)，中國香港、中國臺灣、馬來西亞和加拿大等地陸續(xù)報道H7N9 禽流感病毒感染病例，截至2019年10 月2 日，共造成1 568 例感染、616 人死亡［1］。研究證實H7N9 禽流感病毒在第5 次和第6 次大流行期間，感染家禽和人類且對雪貂和雞群的致病性增強［2-4］。因此，美國疾病預防和控制中心結合流感風險評估結果，將H7N9 亞型禽流感病毒列為高風險病原［5］。流行病學調查表明大部分患者具有活禽接觸史，意味著活禽市場和新型H7N9 流感爆發(fā)存在著緊密的聯系［6］。目前，新型H7N9 病毒無法通過呼吸道、母嬰、血液等方式實現人-人之間的傳播［7］，但它具有與人類感染相關的基因組成［8］，在少量非人源高致病H7N9 毒株中，發(fā)現神經氨酸酶抑制劑（Neuraminidase-inhibitor，NAI）抗性（NA中的R292K）和哺乳動物適應性突變（如PB2 中的E627K 和A588V）［9］。此外，H7N9 禽流感病毒人-人傳播突變動力學模型分析表明，將來H7N9 病毒可以獲得人-人傳播的特征［10］。因此，對H7N9 禽流感病毒的研究工作亟需深入開展，以避免給人類健康造成威脅。

NA 是流感病毒主要囊膜纖突之一，天然NA 蛋白有4 個相同的單體組成四聚體，每種單體全長約470 個氨基酸，并有胞內區(qū)、跨膜區(qū)、莖部區(qū)及頭部區(qū)4 個區(qū)域組成［11］。近來研究成果表明，NA 除了在病毒釋放中發(fā)揮作用，還有助于病毒與細胞糖蛋白唾液酸基團結合，補充血凝素（Hemagglutinin，HA）的受體結合功能，提高NA 酶活性，并促進病毒感染［12］。無論是自然突變還是通過遺傳修飾獲得的NA 活性位點突變體，其框架和催化殘基都可以在不同程度上改變病毒復制能力、感染性和對抗病毒抑制劑的敏感性［11，13］?？傊琋A 在病毒吸附、侵入、釋放以及維持與HA 的功能平衡等方面起著重要的多功能作用［11］。

本研究以新型H7N9 禽流感病毒（安徽株）NA蛋白胞外區(qū)片段為研究對象，進行基本理化性質和高級結構等生物信息學分析。為了在E. coli中實現高效表達，選取NA 蛋白胞外區(qū)序列并進行密碼子優(yōu)化與合成。把構建正確的pET28b-tN9 重組載體轉化至感受態(tài)細胞，將進一步經親和純化、SDS-PAGE檢測及質譜鑒定的目標蛋白免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，以期為N9 亞型禽流感病毒血清學檢測方法的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達載體pET28b（+）、E. coliDH5α 和E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞由新鄉(xiāng)學院醫(yī)學院醫(yī)學檢驗技術中心實驗室保存；E. coliRosetta 和E. coliArctic Express（DE3）感受態(tài)細胞購自南京鐘鼎生物公司；Fast Digest 限制性內切酶Nco I 和Xho I 購自Thermo Scientific 公司；質粒小量制備試劑盒和Solution I 購自TAKARA 公司；DNA 凝膠回收試劑盒購自OMEGA BIO-TEK 公司；Ni Sepharose 6 FF、Sepharose 4B 純化填料購自GE 公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑由新鄉(xiāng)醫(yī)學院提供；HRP 標記山羊抗兔IgG 和DAB 顯色液購自武漢博士德公司；TMB顯色液購自碧云天公司；新西蘭大白兔購自武漢生物制品研究所實驗動物中心；人用H7N9 滅活病毒原液（上海株）由上海生物制品研究所陳則研究員饋贈。

1.2 方法

1.2.1 新型H7N9 禽流感病毒NA 蛋白胞外區(qū)片段的生物學信息分析 參考相關文獻［14］，采用EXPASY系統(tǒng)的Protparam 程序分析新型H7N9 禽流感病毒（安徽株）NA 蛋白胞外區(qū)片段（truncated N9，tN9）理 化 特 征（https：//web.expasy.org/protparam/）；使用Protscale 程序Kyte&Doolittle 算法分析其疏水性（https：//web.expasy.org/protscale/）；使用SOPMA 軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預測二級結構；使用PHYRE2 protein fold recognition server（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）預測全長NA 蛋白和NA 蛋白胞外區(qū)片段三級結構［15］，其PDB 文件用 VMD（Visual Molecular Dynamics）1.9.3軟件進行可視化分析［16］。

根據生物信息學分析結果，按照文獻方法［17］以GenScript Rare Codon Analysis 工具對NA 胞外區(qū)核苷酸序列（1 290 bp）進行基因密碼子優(yōu)化設計，確認目標序列合框后由南京金斯瑞公司進行合成。

1.2.2 目標基因表達載體的構建 目標基因合成時，在5′端添加NcoI 酶切位點（CCATGG），在3′端刪除TAA 終止密碼子，添加XhoI 酶切位點（CTCGAG），合成后克隆至T 載體。以NcoI 和XhoI 雙酶切表達載體pET28b 和上述T 載體，凝膠回收目的序列，以Solution I 進行連接，將連接產物轉化至DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素的LB 平板（終濃度為50 μg/mL），37℃培養(yǎng)16-20 h。以載體通用引物為擴增引物，以重組單菌落為模板，進行PCR鑒定，提取陽性克隆送武漢金開瑞生物工程有限公司進行測序驗證，測序正確的表達質粒命名為pET28b-tN9。

1.2.3 目的蛋白的誘導表達、親和純化與質譜鑒定 將pET28b-tN9 分別轉化E. coliBL21（DE3）、E.coliRosetta 和E. coliArctic Express（DE3）感 受 態(tài)細胞，挑取重組單菌落分別于50 mL 含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當OD 值達到0.5 時，以0.2 mmol/L 的IPTG 終濃度進行誘導，E. coliBL21（DE3）、E. coliRosetta 重組菌分別在30℃和37℃條件下誘導5 h，E. coliArctic Express（DE3）在16℃溫度下誘導過夜。離心收集菌體進行超聲破碎，分離上清和沉淀，以10% SDS-PAGE 分析蛋白的表達情況。

根據上步結果選取其中一種重組菌和誘導條件進行擴大培養(yǎng)，包涵體形式表達的蛋白經變性、復性后，參照相關文獻［18］用鎳柱親和層析法純化目標蛋白，采用不同濃度咪唑溶液進行洗脫，收集流穿液和洗脫液，以10% SDS-PAGE 檢測蛋白純化情況。純化后蛋白濃縮并以SDS-PAGE 電泳檢測蛋白純度，將電泳后目標條帶切割，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行串聯飛行時間質譜（Maldi-toftof）檢測［19］，以進一步驗證目標蛋白。

1.2.4 動物免疫與多克隆抗體制備 將驗證正確的目的蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分混合后，以多點皮下方式免疫新西蘭大白兔（400 μg/只）。免疫前經耳緣靜脈采血并分離血清，用作陰性對照。每2 周免疫1 次，之后用相同劑量的重組蛋白與弗氏不完全佐劑配伍，第4 次免疫一周后采血大量制備抗血清，并準備純化。結合文獻方法［20］，將重組目標蛋白偶聯Sepharose 4B 制備成抗原親和純化層析柱，將所得抗血清與PBS 等量混合后緩慢上樣，待抗體結合后用甘氨酸緩沖液洗脫，然后在PBS 中4℃透析過夜，進行后續(xù)多克隆抗體檢測。

1.2.5 Western blotting 法鑒定多抗特異性 采用Western blotting 方法檢測抗體特異性。將純化的重組蛋白、pet28a 空載體誘導后產物和人用H7N9 滅活病毒原液（上海株），經SDS-PAGE 電泳后電轉至PVDF 膜，以1% BSA 于37℃封閉1 h，PBST 洗滌3次，每次5 min；用制備的多克隆抗體（1∶3 000 稀釋）作為一抗，室溫孵育1 h，PBST 洗滌3 次，每次5 min；加入1∶1 500 稀釋的山羊抗兔HRP-IgG，室溫孵育1 h，PBST 洗滌3 次，每次5 min，DAB 顯色并拍照留用。

1.2.6 間接ELISA 法測定多克隆抗體的效價 將重組蛋白用包被液稀釋成3 μg/mL，每孔100 μL，4℃包被。次日棄去包被液，洗板3 次，每孔加入200 μL 封閉液，37℃恒溫孵育1 h，用于ELISA 檢測。制備的抗體按1∶500 倍比稀釋，HRP 標記的山羊抗兔IgG 稀釋度為1∶2 000，顯色劑為TMB，用酶標儀測定各孔吸光度（A450）值。實驗設陰性血清對照，樣品A450值≥陰性對照A450值的2.1 倍判為陽性。

2 結果

2.1 NA蛋白胞外區(qū)片段生物信息學分析結果

通過Protparam 程序分析，tN9分子式為C2154H3283N623O674S27，分子質量單位為49.6 Ku，理論等電點為6.56，半衰期為30 h（Mammalian）、＞20 h（Yeast）、＞10 h（Escherichia coli），不穩(wěn)定指數43.49，為不穩(wěn)定蛋白。應用Protscale 構建的疏水圖譜顯示，多肽鏈第270 位的Asp 具有最高的分值1.389，疏水性最強，第292 位的Pro 具有最低的分值-2.978，親水性最強，整體來看，該基因編碼蛋白為親水性蛋白。

以SOPMA 軟件預測該重組蛋白二級結構，其結果表明，α 螺旋（Alpha helix，縮寫為h）占7.95%；β 折疊（Extended strand，縮寫為e）占31.82%；β轉角（Beta turn，縮寫為t）占7.73%；無規(guī)則卷曲（Random coil，縮寫為c）占52.50%，主要以無規(guī)則卷曲、β 折疊為主（圖1）。

圖1 SOPMA 軟件預測的tN9 二級結構

將截短前后NA 蛋白序列提交至PHYRE2 服務器自動建模，構建了NA 蛋白截斷前后的三維結構（圖2-A、圖2-B）。將PDB 文件用VMD 軟件進行處理，并以黃色標記出HIS 原子位置，比對分析顯示截短前后蛋白質莖部區(qū)和頭部區(qū)結構無顯著差異，刪除胞內區(qū)和跨膜區(qū)不會影響NA 蛋白免疫原性，HIS tag 暴露于空間之外，可以用于后續(xù)蛋白純化（圖2-C、圖2-D）。

密碼子偏好性是影響蛋白表達的重要因素之一。經在線稀有密碼子分析工具進行密碼子優(yōu)化分析，結果表明tN9 編碼基因密碼子適應指數（Codon adaptation index，CAI）為0.59，GC 含量為43.64%，密碼子使用頻率分布系數CFD 為13%。根據大腸桿菌密碼子偏好性，對tN9 序列稀有密碼子進行同義替換后，CAI 指數為0.91，達到理想值范圍（0.8-1.0），GC 含量為58.55%，符合理想值區(qū)間（30%-70%），有利于后續(xù)蛋白的高效表達。使用序列處理在線工具 包（SMS，http：//www.bio-soft.net/sms/index.html）對優(yōu)化前后的序列進行比對（圖3）。

2.2 pET28b-tN9重組表達載體構建

將靶基因與pET28b 連接，將連接產物轉化E. coliDH5α 感受態(tài)細胞。挑選重組菌落進行PCR鑒定，凝膠電泳顯示在1 500 bp 左右出現目標條帶，與預期大小相符，陽性質粒測序結果進一步證實重組載體構建成功（圖4）。

2.3 目的蛋白的誘導表達

以IPTG 誘導3 種重組菌后，目標蛋白均有表達，僅在Arictic 中有微弱的可溶性表達（圖5 泳道16），表達量較低，其余均為包涵體表達形式（圖5）?？紤]到后續(xù)動物免疫的抗原劑量要求，選擇重組E.coliBL21（DE3）為誘導菌株，進一步擴大培養(yǎng)并進行誘導、表達，誘導條件為30℃，誘導時間為5 h。

2.4 目的蛋白親和純化與質譜鑒定

圖2 NA 蛋白截短前（A、C）后（B、D）結構比對

圖3 tN9 基因序列密碼子優(yōu)化前后比對

圖4 重組菌落PCR 鑒定

圖5 SDS-PAGE 檢測重組tN9 蛋白的表達

誘導結束后，將離心收獲的菌體進行超聲破碎，以含8 mol/L 尿素的PBS 重懸沉淀，使之徹底溶解，并在含4 mol/L 尿素、2 mol/L 尿素、1 mol/L 尿素的Buffer 中透析，然后上柱親和純化，并用100 mmol/L、150 mmol/L 和250 mmol/L 的咪唑梯度進行洗脫，收集洗脫液，進行SDS-PAGE 鑒定（圖6-A）。混合梯度洗脫樣品，以BSA 標準品為對照，SDSPAGE 分析其純度不低于85%。切膠后目標條帶（圖6-B）進行串聯飛行時間質譜分析，經數據庫搜索，得到的蛋白質匹配得分為455，分子質量49 524u，等電點（Isoelectric point，PI）6.56，匹配度21%（圖7）。

圖6 SDS-PAGE 檢測tN9 重組蛋白親和純化產物

2.5 Western blotting法鑒定多抗特異性

Western blotting 檢測結果表明，于圖8 泳道1和3，50 kD 左右位置各出現一條蛋白條帶（tN9 分子量49.6 kD，全長NA 分子量51.8 kD），表明制備的抗體能與經IPTG 誘導的重組蛋白和天然新型H7N9 禽流感病毒（上海株）發(fā)生特異性反應，具有良好的反應原性。

2.6 多克隆抗體的效價檢測

將tN9 蛋白免疫兔子制備的抗體進行1∶500 倍比稀釋，間接ELISA 法測定抗體效價，結果顯示效價為1∶25 6000（圖9）。

3 討 論

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，新型H7N9 禽流感病毒是H7N3 禽流感病毒、HX（2或11）N9 流感病毒和H9N2禽流感病毒的重配株。該病毒HA 基因來自鴨源H7N3 病毒，NA 基因來自于候鳥源HX（2或11）N9 病毒，其余的6 個基因（PB2、PB1、PA、NP、M 和NS）來自H9N2 病毒［6］。經過多亞型病毒重配后，賦予了H7N9 病毒新的流行特征：對人和哺乳動物具有高致病性，但對包括雞在內的家禽一般具有低致病性；具有截短的NA 蛋白，莖部缺失5 個氨基酸；部分人源H7N9 病毒分離株在受體結合位點HA 中存在天然Q226L 突變、PB2 蛋白在第627 和701 位置具有Lys 和Asn 突變；鳥源H7N9 分離株PB2 蛋白在第627 和701 位置保留Glu 和Asp，這些新特征對于H7N9 禽流感病毒在哺乳動物宿主上呼吸道進行復制是非常重要的［6］。

圖7 tN9 蛋白數據庫搜索結果

圖8 Western blotting 鑒定tN9 多克隆抗體免疫反應性

圖9 ELISA 檢測tN9 蛋白多克隆抗體效價

流感病毒基因易發(fā)生抗原漂移、抗原轉換，從而可能導致流感爆發(fā)，NA 基因是流感病毒基因組突變率較高的基因［21］。在一些H7N9 臨床分離株中發(fā)現了與耐藥性相關的NA 氨基酸突變位點，NAR292K，研究表明H7N9 分離株NA 的R292K 取代，對奧司他韋和帕拉米韋產生高度耐藥性，對扎那米韋產生部分耐藥性。而且，耐藥突變位點的H7N9病毒株，在人體的病毒復制能力、對小鼠的毒力和在豚鼠間的傳播能力，與未發(fā)生突變的病毒株相比沒有差別［22］。NA 作為受體破壞酶，可以切割α 2-3 和α 2-6 連接唾液酸，釋放病毒顆粒［23］，為了進一步確定NA 在病毒受體結合中的可能作用，對人畜共患H7N9 病毒株的N9 NA 比對、分析，結果證實N9 NA 具有與唾液酸結合的活性血細胞吸附（Hemadsorption，Hb）位點，其不尋常的唾液酸酶位點動力學特征，可增強病毒與唾液酸受體類似物的整體結合能力，尤其是增強和人α 2，6-連接唾液酸相似受體的結合［24］。因此，亟需深入開展對N9蛋白結構突變和受體功能活性的研究。

目前，流感病毒疫苗的有效成分主要基于HA蛋白，研究表明NA 可能也具備良好的免疫原性［25］。研究人員制備了基于NA 的重組病毒樣顆粒疫苗，免疫N1 NA VLPs 的雪貂產生高滴度的血清NA 抑制抗體（NA-inhibition，NI），可以保護雪貂免受致死劑量的病毒侵襲，這為基于NA 疫苗的開發(fā)提供了支持［26］。目前，尚無關于N9 NA 作為疫苗標靶的報道，試推測N9 蛋白可能同樣存在病毒特異性抗原表位，誘導產生保護性抗體?？傊?，NA 在病毒侵入、釋放、小分子藥物作用標靶和免疫原性方面發(fā)揮多重重要功效［25］，因此，深入研究NA 的結構和功能、NA 在流感感染和復制周期中的復雜作用，特別是H7N9 病毒HA 和NA 糖蛋白如何各自發(fā)揮作用，實現功能平衡以維持病毒適應性等方面具有重要意義［11］，然而目前尚無針對N9 蛋白的特異性抗體，這一定程度上限制了對N9 蛋白的深入研究。

隨著技術的進步，人們對流感病毒的研究日益深入，但對HA 糖蛋白的研究較多，對NA 的報道較少，僅有在酵母［27］、哺乳動物細胞［28］和昆蟲細胞［29］等中可溶性表達H5N1 病毒和H1N1 病毒NA 單體和四聚體的報道，對于N9 的表達和純化，Margine 等［30］以桿狀病毒表達系統(tǒng)表達并純化NA蛋白，而關于N9 基因原核表達及免疫原性的研究鮮有報道。本試驗通過基因重組方法，利用pET28b表達tN9 蛋白，IPTG 誘導后經SDS-PAGE 鑒定，基本以包涵體形式存在。吳艷菊等［31］、萬潤等［21］分別以原核表達系統(tǒng)表達H5N1 亞型和H6N6 亞型流感病毒的NA，表達蛋白均以包涵體形式存在，這與本試驗結果一致。本研究表達的安徽株H7N9 流感病毒tN9 包涵體經變性、復性后制備的多抗，Western blotting 顯示其與人用H7N9 禽流感病毒（上海株）結合較弱（H7N9 禽流感病毒全病毒上樣量5 μL），以H7N9 禽流感病毒（上海株）作為包被抗原，ELISA 檢測效價僅為1∶2 000（H7N9 禽流感病毒全病毒以1∶1 000 稀釋包被，該部分數據未顯示），可能的主要原因為：NA 蛋白的含量本身不高（無法準確定量H7N9 全病毒中的NA 含量）；以當前的包涵體蛋白變性、復性工藝獲得的目標蛋白與天然蛋白可能存在一定的結構和功能差異；上海株H7N9 禽流感病毒NA 氨基酸存在突變［32］（上海株N9 是K294，安徽株N9 是R294），從而影響了二者之間的結合活性。

4 結論

本研究采用生物信息學方法對新型H7N9 禽流感病毒NA 蛋白胞外區(qū)抗原進行預測，刪除NA 胞質區(qū)和跨膜區(qū)并對截斷后的片段進行原核表達及多克隆抗體制備。純化的tN9 蛋白具有良好的免疫原性，能誘導兔子產生高水平免疫反應，所制備的特異性多克隆抗體具有較高的效價，可用于開展NA蛋白結構和功能研究，也可用于建立H7N9 禽流感病毒血清學檢測方法，為進一步探討NA 蛋白特性、H7N9 病毒對人和動物的感染機制以及新型疫苗的開發(fā)提供了條件。