徐軍 王瑞 李銳 高海俠 張瑞良 王文靜 趙霞 李琳

（安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036）

鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）是世界上分布最廣泛的食源性病原菌之一，可廣泛感染人和動物，引起食源性、感染性腹瀉和敗血癥等，嚴重威脅養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和人類健康［1］。目前，抗生素是治療鼠傷寒沙門菌感染的最有效手段。然而，長期不合理使用和濫用抗生素使得病原菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性，對獸醫(yī)臨床和動物性食品安全帶來極大挑戰(zhàn)［2］。多重耐藥外排泵系統(tǒng)是引起細菌產(chǎn)生耐藥性的最常見原因之一，同時也是細菌生物膜形成和毒力所必需的，因其作用底物廣泛且與細菌的多種生理功能相關(guān)而被人們廣泛關(guān)注［3］。其中AcrABTolC 是革蘭陰性菌中最重要的多重耐藥外排泵，也是目前研究最清楚的三聯(lián)外排泵系統(tǒng)，其表達水平受多種調(diào)控基因的調(diào)節(jié)［4］。

雙組份信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)（Two-component system，TCS）普遍存在于細菌中，可調(diào)節(jié)包括運動性、毒力、新陳代謝、抗生素耐藥性和應激反應等過程［5］。BaeSR 雙組分系統(tǒng)首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，隨后相繼在沙門菌和鮑曼不動桿菌中發(fā)現(xiàn)［6-8］。Lin 等［9］證明在沙門菌中BaeSR 可直接與STM3031 的啟動子區(qū)域結(jié)合，從而調(diào)節(jié)其對頭孢曲松的耐藥性。Rosner 等［10］發(fā)現(xiàn)當某些有毒代謝物在細胞中積累時，BaeSR 和CpxAR 系統(tǒng)被激活，進而激活AcrD和MdtABC 多重耐藥外排泵，調(diào)控大腸桿菌對多種抗生素的敏感性。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)，acrB的存在可能會掩蓋其他外排泵的功能，從而阻礙baeSR對其他多重耐藥外排泵的調(diào)控［11］。因此，BaeSR 和AcrB 對于研究抗生素耐藥性產(chǎn)生的機制至關(guān)重要。

隨著測序技術(shù)的不斷進步，RNA-Seq 技術(shù)已經(jīng)成為細菌耐藥性研究中的一種常用實驗手段。細菌在抗生素作用條件下，本身存在的多種耐藥相關(guān)基因的表達量會發(fā)生一定的變化，利用轉(zhuǎn)錄組學研究方法，可以探究細菌耐藥前后發(fā)生差異表達的基因，從而分析細菌產(chǎn)生耐藥性的原因［12］。RNA-Seq技術(shù)不僅可以對已知的耐藥機制進行確證，還可以從篩選得到的差異表達基因中尋找新的耐藥機制，從而揭示其功能及其可能在代謝過程中發(fā)揮的作用。本研究通過對鼠傷寒沙門菌CR、CR△acrB及CR△baeSR△acrB基因缺失株進行轉(zhuǎn)錄組學測序分析，以期篩選與耐藥相關(guān)差異表達基因并對其表達量變化、發(fā)揮的功能進行分析，為進一步探討鼠傷寒沙門菌產(chǎn)生耐藥性的機制，尋找潛在或新的藥物靶標，遏制細菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠傷寒沙門菌ATCC13311 體外誘導環(huán)丙沙星耐藥株CR 由本實驗室保存，CR△acrB、CR△baeSR△acrB基因缺失株均由本實驗室構(gòu)建。LB 肉湯購自上海生工生物有限公司，RNA 提取試劑盒、RNA純化試劑盒均購自QIAGEN 公司，TransStart Green qPCR SuperMix 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 將鼠傷寒沙門菌CR、CR△acrB和CR△baeSR△acrB分別劃線接種于LB 固體平板，置于37℃培養(yǎng)16 h 后，分別挑取單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min 過夜培養(yǎng)；次日，1∶100 轉(zhuǎn)接于新鮮LB 液體培養(yǎng)基中，生長至對數(shù)生長期時收集菌液，于4℃ 5 000 r/min 離心10 min 后棄上清，并用PBS 洗3 次，收集菌體，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA 的提取與檢測 由北京諾禾致源科技股份有限公司對所有樣品進行RNA 抽提，用瓊脂糖凝膠電泳對RNA 降解程度以及是否有污染進行檢測，用Nanodrop（OD260/OD280）對RNA 的純度進行檢測，用Qubit 對RNA 的濃度進行精確定量檢測，最后使用Agilent 2100 對RNA 的完整性進行精確檢測。

1.2.3 文庫構(gòu)建與測序 檢測合格后的樣品通過Ribo-zero 試劑盒去除rRNA，加入fragmentation buffer 對樣品進行片段化處理以及合成雙鏈cDNA，并用AMPure XP beads 對其純化。對純化后的雙鏈cDNA 進行末端修復、加A 尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads 進行片段大小選擇。最后進行PCR 擴增，并用AMPure XP beads 純化PCR 產(chǎn)物，得到最終的cDNA 文庫，將構(gòu)建好的文庫使用HiSeq測序平臺進行測序。

1.2.4 差異基因表達分析 采用HTSeq 軟件對各樣品進行基因表達水平分析，比對結(jié)果使用 FPKM（Fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）法進行計算，差異表達基因的篩選標準為|log2（Fold Change）| ＞ 1 且q value ＜ 0.005。

1.2.5 差異基因GO 和KEGG 富集分析 采用GOseq 方法對所有篩選到的差異表達基因進行GO富集分析，明確差異表達基因在 Gene Ontology 中的分布狀況。以KEGG 數(shù)據(jù)庫中Pathway 為單位，應用超幾何檢驗，找出在差異表達基因中顯著性富集的Pathway，進一步確定差異表達基因所參與的代謝通路及發(fā)揮的生物學意義。

1.2.6 差異表達基因的驗證 隨機選取7 個耐藥相關(guān)差異表達基因，根據(jù)NCBI 中公布的鼠傷寒沙門菌的基因組序列（CP009102.1），以沙門菌GAPDH為內(nèi)參基因，利用Oligo 6.0 設計所用引物，引物名稱及序列見表1。采用SYBR Green I 法進行mRNA表達量分析，數(shù)據(jù)采用2-△△Ct處理。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估及基因組比對結(jié)果

檢測樣品中CR、CR△acrB和CR△baeSR△acrB的 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為1 188，372 和688 ng/μL；OD260/280分 別 為2.077、2.11 和2.02，OD260/230分 別為2.055、1.01 和0.76，滿足建庫測序的要求。從轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析報告中得知，CR、CR△acrB和CR△baeSR△acrB分別獲得 11 693 470、13 342 112和108 24 816 條原始序列，對原始數(shù)據(jù)進行過濾后，剔除低質(zhì)量數(shù)據(jù)的Clean reads 分別為11 311 842、12 959 780 和10 500 966，其錯誤率分別為0.03%、0.02%和0.02%。通過Bowtie2 將過濾后的測序序列進行基因組定位分析，結(jié)果顯示鼠傷寒沙門菌CR、CR△acrB和CR△baeSR△acrB的比對結(jié)果分別是95.74%、97.60%和97.19%（表2）。該結(jié)果證明本次測序準確性較高，后續(xù)可直接用該部分數(shù)據(jù)進行分析。

表2 數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量統(tǒng)計

2.2 基因差異表達分析

采用HTSeq 軟件對各樣品進行基因表達水平分 析，以 同 時 滿 足|log2（Fold Change）| ＞ 1 且q value ＜ 0.005 為標準對差異表達基因進行篩選。以CR△acrB、CR 為比較組，共篩選到1 320 個差異表達基因，其中894 個基因表達下調(diào)，426 個基因表達上調(diào)（圖1-A）；以CR△baeSR△acrB、CR 為比較組，共篩選到1 377 個差異表達基因，其中972 個基因表達下調(diào)，405 個基因表達上調(diào)（圖1-B），從上述結(jié)果中篩選部分耐藥相關(guān)差異表達基因（表3）。

2.3 差異表達基因的GO富集分析

采用GOseq 將差異表達基因注釋在Gene Ontology 中，GO 分為分子功能（Molecular function）、生物過程（Biological process）和細胞組分功能（Cellular component）3 個部分。根據(jù)試驗目的篩選差異基因后，富集分析差異基因在 Gene Ontology 中的分布狀況。以CR△acrB、CR 為比較組得到30 個GO 功能注釋（圖2-A），其中分子功能類4 個，無顯著富集；生物過程16 個，主要集中在跨膜運輸、細胞定位、細胞黏附等功能；細胞組分功能10 個，主要集中在細胞膜及其相關(guān)組成成分。以CR△baeSR△acrB、CR 為比較組得到30 個GO 功能注釋（圖2-B），其中分子功能類5 個，無顯著富集；生物過程16 個，主要集中在細胞運動、跨膜運輸、細胞黏附、纖毛或鞭毛運動、細胞定位等功能；細胞組分功能9 個，主要集中在細胞膜及其膜的組成部分。

圖1 差異基因分布火山圖

表3 耐藥相關(guān)差異表達基因

2.4 差異表達基因的KEGG Pathway富集分析

在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學功能，通過Pathway 顯著性富集能確定差異表達基因參與的最主要生化代謝和信號轉(zhuǎn)導途徑。以CR△acrB、CR 為比較組（圖3-A），結(jié)果顯示1 071個差異表達基因在數(shù)據(jù)庫中注釋到88 個信號通路，其中581 個差異基因表達下調(diào)，490 個差異基因表達上調(diào)；以CR△baeSR△acrB、CR 為比較組（圖3-B），結(jié)果顯示1 086 個差異表達基因在數(shù)據(jù)庫中注釋到86 個信號通路，其中605 個差異基因表達下調(diào)，481 個差異基因表達上調(diào)。差異基因主要富集在代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物合成、ABC 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)、鞭毛組裝、β-內(nèi)酰胺抗性等通路。

2.5 差異表達基因的qRT-PCR驗證

隨機篩選7 個差異表達基因，以GADPH 為內(nèi)參基因，與RNA-Seq 分析結(jié)果相比，qRT-PCR 的檢測結(jié)果與其基本一致（圖4）。隨機選取的7 個差異表達基因在qRT-PCR 和RNA-Seq 中的誘導表達變化趨勢相同，從而證實了RNA-Seq 分析結(jié)果的可靠性。

圖2 GO 功能富集

圖3 KEGG 通路富集

圖4 部分差異表達基因qRT-PCR 驗證結(jié)果

3 討論

近年來，從分子水平上揭示沙門菌的耐藥機制，已成為沙門菌最重要的研究方向之一［13］。鼠傷寒沙門菌的耐藥性主要依賴于外排泵系統(tǒng)、雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)、生物膜等因素?？咕幬锬退幭嚓P(guān)外排泵可分為5 大家族，其中RND 家族主要以三聚體形式轉(zhuǎn)運底物，通常由染色體基因編碼，其結(jié)構(gòu)由膜融合蛋白、RND 轉(zhuǎn)運蛋白和外膜因子組成。在革蘭陰性菌中，RND 家族外排泵作為最主要的多重耐藥外排泵通過從細菌細胞中泵出多種抗微生物化合物來賦予其多重耐藥性，在沙門菌耐藥性方面發(fā)揮著不可替代的作用［14］。AcrB因其作用底物廣泛且在多種革蘭陰性菌中均存在其同源物，被認為是對人類健康最重要的RND 系統(tǒng)［15］。雙組分信號轉(zhuǎn)導機制可以調(diào)節(jié)細菌對環(huán)境的適應性從而影響其對抗生素的敏感性，如BaeSR 可通過激活RND 型外排泵AcrD 和MdtABC 的轉(zhuǎn)錄改變沙門菌的多要耐藥性［10，16-17］。本實驗室致力于鼠傷寒沙門菌耐藥機制的研究，通過自殺質(zhì)粒介導的同源重組系統(tǒng)構(gòu)建acrB和baeSR的基因缺失株，并對其進行運動性、生物膜的形成、耐藥性等方面的研究，結(jié)果顯示，acrB和baeSR基因缺失導致生物膜形成能力下降，耐藥性減弱，表明基因acrB和baeSR可調(diào)控鼠傷寒沙門菌的耐藥性。為進一步探究其耐藥機理，對CR、CR△acrB以及CR△baeSR△acrB進行轉(zhuǎn)錄組測序。

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示CR△acrB/CR、CR△baeSR△acrB/CR 分別篩選到1 320、1 377 個差異表達基因。CR△acrB/CR 中894 個基因表達下調(diào)，426 個基因表達上調(diào)；CR△baeSR△acrB/CR 中972個基因表達下調(diào)，405 個基因表達上調(diào)。通過對差異表達基因進行GO 功能分類發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要參與跨膜運輸、細胞黏附、纖毛或鞭毛運動以及細胞定位等生物學功能，生物膜以及膜的組成部分等細胞組分功能，這些生物過程均與細菌耐藥性有著密切聯(lián)系。先前得到的acrB和baeSR基因缺失可以導致生物膜形成能力下降、運動性降低、耐藥性減弱等試驗結(jié)果與其基本一致。通過KEGG 富集分析和以往文獻報道對轉(zhuǎn)錄組學結(jié)果進行深入分析，篩選出CR△acrB和CR△baeSR△acrB共同變化的耐藥相關(guān)差異表達基因，包括STM3031、pmrF、fliA、OmpR、csgD、emrA、mdtC和yejE等。

STM3031 已被證實可賦予沙門菌頭孢曲松抗性，本團隊對acrB基因缺失后可造成STM3031 表達量顯著下調(diào)，acrB和baeSR基因缺失后表達量進一步下降，與Lin 等［9］實驗結(jié)果一致。KEGG Pathway 富集分析顯示pmrF屬于氨基糖和核苷酸糖代謝途徑，可參與調(diào)節(jié)細菌對多黏菌素的抗性［18］。細菌生物膜的形成與臨床感染密切相關(guān)，鞭毛在生物膜的形成初期起著重要的介導黏附作用，并為生物膜的形成提供動力［19］。因此，生物膜和鞭毛運動都是引起細菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因。本研究中OmpR基因表達量顯示上調(diào)，csgD、fliA、fliC、fliG等相關(guān)基因均顯示不同程度的下調(diào)。其中OmpR屬于雙組份信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，可激活外膜孔蛋白相關(guān)基因、脂多糖修飾相關(guān)基因等的轉(zhuǎn)錄［20］。CSG 區(qū)由csgBA和csgDEFG組成，可編碼菌毛等相關(guān)基因，csgD是重要的生物膜轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在細胞黏附、聚集和生物膜形成方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用［21］。朱春紅等［22］通過構(gòu)建的不同腸炎沙門菌的fliC基因缺失株，證明其在生物膜形成過程中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果證實acrB和baeSR可通過調(diào)控沙門菌的鞭毛運動和生物膜形成能力改變其對抗生素的敏感性。

外排泵在細菌多重耐藥性方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，本研究篩選到多個外排泵相關(guān)基因均與以往報道相符。其中emrA屬于主要易化因子家族（MFS），可與emrB、tolC結(jié)合形成三聯(lián)體系；mdtC屬于RND 家族外排泵，BaeSR 可激活mdtC的表達；yejE屬于ABC 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，均可介導菌株對黏菌素、新生霉素的耐藥性［23］。因此，多種外排泵相關(guān)基因的表達量發(fā)生變化，可能是acrB和baeSR調(diào)控鼠傷寒沙門菌產(chǎn)生耐藥性的主要原因。在后續(xù)研究中，我們將對STM1545、fliA、csgD和pmrf進行EMSA 驗證，進一步明確鼠傷寒沙門菌雙組分系統(tǒng)BaeSR 和AcrB的耐藥調(diào)控機制。

4 結(jié)論

本研究初步探討了鼠傷寒沙門菌acrB和baeSR基因缺失后的表達變化，發(fā)現(xiàn)菌株對抗生素的敏感性可能通過AcrB 和BaeSR 介導的多重耐藥外排泵基因的表達、細胞膜的通透性、核苷酸代謝以及鞭毛運動等多種耐藥機制調(diào)控。