胡建燃 李平 鐵軍 金山

（長治學(xué)院，長治 046011）

紫丁香（Syringa oblataLindl.）為木樨科（Oleace）丁香屬（Syringa）植物，落葉灌木或小喬木，在我國從西南到東北均有分布［1-2］。紫丁香花期較長，花淡紫色或紫紅色，圓錐花絮，氣味芳香濃郁。紫丁香不僅作為綠化和觀賞植物，而且具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也是提煉芳香精油的優(yōu)質(zhì)原料［3］。

植物精油是一類從植物中提取的具有一定揮發(fā)性的油狀物質(zhì)，大多數(shù)具有香氣或其它特異氣味，組分比較復(fù)雜［4-5］。具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗菌、消炎、防腐、解熱、鎮(zhèn)痛等作用［6-10］，廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道了紫丁香花精油的成分組成，張文靜等［11］采用SDE 法提取新鮮紫丁香花精油，用GC/MS 法，鑒定出64 種揮發(fā)性成分。孫潔雯等［12］采用固相微萃取法分別提取不同花期的紫丁香花香氣成分，經(jīng)GC/MS 分析，共鑒定出44 種揮發(fā)性成分，不同花期的成分在種類和含量上也有所不同。在藥理活性方面，國內(nèi)外學(xué)者對紫丁香葉精油已有一定研究，表明其具有抗乙型肝炎病毒［13］、抗單皰病毒性角膜炎［14］以及流行性出血性結(jié)膜炎［15］等作用。然而，針對紫丁香花精油生物活性的研究，目前鮮有報(bào)道。

活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）是機(jī)體在新陳代謝過程中不斷產(chǎn)生的。在正常的生理狀態(tài)下，生物機(jī)體通過酶類與非酶類體系來維持細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的動(dòng)態(tài)平衡。ROS 在不斷產(chǎn)生及清除的過程中保持氧化-還原系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡［16］。如果ROS 產(chǎn)生增多或還原系統(tǒng)功能喪失導(dǎo)致ROS 過剩，則可能損傷細(xì)胞內(nèi)包括DNA、蛋白質(zhì)、糖類等生物大分子，破壞其功能，誘發(fā)腫瘤等多種疾病。近年來，植物揮發(fā)性成分在抗氧化和抗腫瘤方面的作用已逐漸引起國內(nèi)外學(xué)者的注意，顧仁勇等［17］的研究表明牛至、丁香、連翹、山蒼子及肉桂的精油成分均具有一定的抗氧化能力；陸占國等［18］發(fā)現(xiàn)蕪荽莖葉精油能有效清除DPPH 自由基；魏鳳香等［19］證實(shí)迷迭香精油可抑制HeLa 細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)其凋亡。但是，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道紫丁香花精油的抗氧化和抗腫瘤作用方面的研究。本研究以水蒸氣蒸餾法提取的紫丁香花蕾精油，探討其體外抗氧化活性，并進(jìn)一步分析其對胃癌細(xì)胞MGC80-3 和HGC-27 的抑制作用，為紫丁香花精油的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料和試劑 紫丁香花蕾于2017 年4 月25日15：00 至16：00 間采自山西省長治市長治學(xué)院校園內(nèi)（東經(jīng)113.143393，北緯36.217117），由長治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系鐵軍教授鑒定為木犀亞科丁香族丁香屬紫丁香（Syringa oblataLindl.）。

胃癌細(xì)胞系MGC80-3 和HGC-27 購自武漢博士德生物工程有限公司；培養(yǎng)基RPMI-1640 購自美國Gibco 公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基四氮唑溴化物（3-（4，5-Dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2H- tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）購自美國Sigma 公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）購自北京依托華茂生物科技有限公司產(chǎn)品；總抗氧化試劑盒和羥自由基檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。其余所用的試劑，如無水乙醇、無水甲醇、乙醚等均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為雙蒸水。

1.1.2 儀器 RE-5ZAA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），KQ-250 醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SHB 循環(huán)水式真空泵（鞏義市子華儀器有限公司），BSA 124S-CW 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），BPX-82 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國熱電公司），SpectraMax M2 多功能酶標(biāo)儀（美谷分子儀器（上海）有限公司），XSP-6C 光學(xué)倒置顯微鏡（日本Olympus 公司），超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），ND2000 微量分光光度計(jì)（上海市精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 紫丁香花精油的提取 將采摘的新鮮的紫丁香花挑選出未開放的花蕾，蒸餾水清洗、吸水紙吸干后，稱100 g 花蕾，放入燒杯中，加入600 mL 蒸餾水浸泡6 h，然后轉(zhuǎn)移至水蒸氣蒸餾裝置中進(jìn)行提取，蒸餾4 h，收集餾出液，無水乙醚萃取，合并萃取液，加入無水硫酸鈉干燥，再蒸除乙醚，即得紫丁香花精油，-20℃保存?zhèn)溆?。提取的精油為透明淡黃色液體，氣味芳香。按照如下公式計(jì)算，精油提取率為0.412%。

提取率% = 所得精油質(zhì)量/ 所用花蕾質(zhì)量×100%

1.2.2 紫丁香花精油抗氧化活性測定 參照文獻(xiàn)［20］中的方法測定精油抗氧化活性。

1.2.2.1 DPPH 自由基清除能力 用無水乙醇配制0.05 mg/mL 的DPPH 溶液，4℃ 避光保存，備用。用無水乙醇配制質(zhì)量濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 和4.0 mg/mL 的精油溶液。取不同濃度的樣品100 μL 和100 μL 0.05 mg/mL 的DPPH 溶 液 加 入96孔板中，混勻，在室溫下避光反應(yīng) 30 min，利用酶標(biāo)儀測定517 nm 處的吸光值OD1，同樣測定100 μL樣品溶液與100 μL 無水乙醇混合液在517 nm 處的吸光值OD2，再測定100 μL DPPH 溶液與100 μL 無水乙醇混合液在517 nm 處的吸光值OD3，清除率按下式計(jì)算，并以食品工業(yè)常用的化學(xué)抗氧化劑2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）為陽性對照，平行測定3 次。

清除率%=［1-（OD1-OD2）/OD3］× 100%

1.2.2.2 羥自由基清除能力測定 用無水乙醇配制質(zhì)量濃度為0.125，0.25，0.5，1.0，2.0 和4.0 mg/mL的精油溶液，并配制同樣質(zhì)量濃度梯度的BHT 溶液作為陽性對照，空白對照為無水乙醇。按試劑盒說明書的步驟進(jìn)行測定，羥自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率%=（OD對照組-OD測定組）/OD對照組×100%

根據(jù)各樣品在不同濃度下對羥自由基的清除率，通過擬合計(jì)算IC50值，即清除率為50%時(shí)的樣品濃度，樣品的IC50值越小，其對羥自由基的清除能力越強(qiáng)。

1.2.2.3 總抗氧化能力測定 用無水乙醇配制4.0mg/mL 的精油溶液，取0.1 mL 樣品液，按照試劑盒說明書進(jìn)行總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）測定。以化學(xué)抗氧化劑2，6-二叔丁基對甲酚（3，5-Di-tert-butyl-4-hydroxytoluene，BHT）作為陽性對照，測定520 nm 處的吸光值。定義：在37℃時(shí)，每分鐘每毫克精油使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01 時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位。計(jì)算公式為：

Vs為反應(yīng)體積3.7 mL；Vt為參與反應(yīng)的精油樣品或陽性對照樣品體積0.1 mL；△OD 為吸光值單位增加值0.01；T 為反應(yīng)時(shí)間30 min；Mt為精油濃度或陽性對照濃度（4 mg/mL）。

1.2.3 紫丁香花精油抗腫瘤活性測定

1.2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 人胃癌細(xì)胞MGC80-3 采用含10% 胎牛血清的1640 培養(yǎng)基（100 U/mL 青-鏈霉素），置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，利用0. 25% 的胰酶-EDTA消化、傳代。利用DMSO 溶解紫丁香花精油，配制成濃度為50 mg/mL 的母液，然后依次稀釋成濃度為20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL 的工作液。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，配制濃度為3×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種200 μL，培養(yǎng)12 h后，加入不同濃度的紫丁香花精油，使終濃度分別為：1.00 mg/L，0.50 mg/L，0.25mg/L，0.13 mg/L，0.06 mg/L，0.03mg/L。每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3.2 MTT 法測定細(xì)胞活力 紫丁香花精油處理細(xì)胞48 h 后，避光加入20 μL MTT（5 mg /mL），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱4 h 后，棄掉培養(yǎng)基，每孔加150 μL DMSO，避光振蕩10 min，至結(jié)晶完全溶解。利用酶標(biāo)儀測定波長490 nm 處的吸光值，按照如下公式，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

細(xì)胞生長抑制率＝（OD對照組-OD測定組）/OD對照組×100%

1.2.3.3 TUNEL 法檢測紫丁香花精油對胃癌細(xì)胞凋亡的影響 參照文獻(xiàn)［21］的方法，采用TUNEL 法檢測紫丁香花精油對胃癌細(xì)胞凋亡的影響。具體步驟如下：將對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞MGC80-3 和HGC-27 分別接種于35 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待匯合率達(dá)到40%左右，更換為新鮮的全培養(yǎng)基，并按照體積比1/20 分別加入濃度為10 mg/mL、2.5 mg/mL 和0.625 mg/mL 的紫丁香花精油工作液，使其終濃度分別達(dá)到0.5 mg/mL、0.13 mg/mL 和0.03 mg/mL；陽性對照組細(xì)胞則加入體積比1/20 的濃度為25 μg/mL 的順鉑（Diaminodichloroplatinum，DDP）溶液，使其終濃度為1.25 μg/mL；陰性對照組細(xì)胞加入等體積的DMSO。將細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h 后，棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定30 min。用磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered solution，PBS）洗滌細(xì)胞1 次，然后用PBS 配制的0.3% Triton X-100在室溫孵育5 min。用PBS 洗滌細(xì)胞1 次，然后用PBS 配制的0.3% H2O2在室溫下處理細(xì)胞20 min。然后，按照試劑盒說明書步驟，加入生物素標(biāo)記液，37℃避光孵育60 min 后，加入標(biāo)記反應(yīng)終止液，室溫孵育10 min。PBS 洗滌3 次后，加入Streptavidin-HRP 工作液，室溫孵育10 min。再用PBS 洗滌3 次后，加入DAB 顯色液，室溫孵育30 min。在光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5 個(gè)視野，每個(gè)視野統(tǒng)計(jì)300 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)，公式如下：

細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 紫丁香花精油抗氧化活性測定

2.1.1 紫丁香花精油的DPPH 清除能力 由圖1 可知，紫丁香花精油對DPPH 的清除能力與精油濃度呈明顯的劑量依賴效應(yīng)，隨著精油濃度的增加，DPPH 清除能力隨之增強(qiáng)。當(dāng)精油濃度為4 mg/mL 時(shí)，其DPPH 清除率達(dá)到75.753%。通過計(jì)算得出，紫丁香花精油的IC50值為1.249 mg/mL，而高于化學(xué)抗氧化劑BHT 的IC50值為0.299 mg/mL，說明紫丁香花精油粗品具有一定的DPPH 清除能力，其清除能力弱于BHT。

圖1 精油的DPPH 清除能力

2.1.2 紫丁香花精油的羥自由基清除能力 圖2 中曲線顯示，紫丁香花精油對羥自由基的清除能力呈劑量效應(yīng)，清除率隨著樣品濃度的增加而增大，當(dāng)精油濃度4.0 mg/mL 時(shí)，對羥自由基的清除能力達(dá)到77.116%。根據(jù)不同濃度下樣品的羥自由基清除率，計(jì)算紫丁香花精油對羥自由基清除能力的IC50值是1.298 mg/mL，BHT 清除羥自由基的IC50值為0.268 mg/mL，表明紫丁香花精油具有一定的羥自由基清除能力，但是弱于BHT。上述結(jié)果表明在下一步的研究中，有必要進(jìn)一步純化該精油粗品的有效成分，提高其單位質(zhì)量的羥自由基清除能力。

圖2 精油的羥自由基清除能力

2.1.3 紫丁香花精油的總抗氧化能力 結(jié)果如圖3所示，調(diào)整紫丁香花精油樣品濃度至4 mg/mL，通過試劑盒檢測，其T-AOC 值19.86±1.74 U/mg，高于化學(xué)抗氧化劑BHT（T-AOC 值為0.38±0.08 U/mg）。結(jié)果表明雖然紫丁香花精油對DPPH 和羥自由基的清除能力弱于BHT（圖1-2），但是就總抗氧化能力而言，則顯著強(qiáng)于BHT（P＜0.01），提示紫丁香花精油具有開發(fā)為天然抗氧化劑的潛力。

圖3 精油的總抗氧化能力

2.2 紫丁香花精油的抗腫瘤活性

2.2.1 紫丁香花精油抑制胃癌細(xì)胞增殖 利用不同濃度的紫丁香花精油處理胃癌細(xì)胞MGC80-3 和HGC-27 48 h 后，經(jīng)MTT 實(shí)驗(yàn)檢測其對上述細(xì)胞的抑制率。結(jié)果如圖4-A 所示，當(dāng)精油終濃度從0.03 mg/mL 增 大 至1.0 mg/mL 時(shí)，對MGC80-3 和HGC-27 細(xì)胞的抑制率分別從1.929%和6.144%升高至77.744%和73.886%，計(jì)算IC50分別為0.282 mg/mL和0.268 mg/mL。相比而言，陽性對照藥物DDP 對MGC80-3 和HGC-27 細(xì)胞的IC50值分別3.049 μg/mL和1.238 μg/mL，如圖4-B 所示，因此紫丁香花精油的抑制效應(yīng)弱于經(jīng)典抗癌藥物DDP。上述結(jié)果表明，雖然抑制作用弱于DDP，但是紫丁香花精油能夠抑制上述兩種胃癌細(xì)胞的增殖，且具有濃度依賴性。

圖4 紫丁香花精油和DDP 對胃癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)

2.2.2 紫丁香花精油誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡 用不同濃度的紫丁香花精油處理胃癌細(xì)胞MGC80-3 和HGC-27 48 h 后，通過TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖5 和圖6 所示，精油終濃度越高，凋亡細(xì)胞（見圖5 和圖6 中B、C 和D 箭頭所指）數(shù)量越多，也越接近1.25 μg/mL DDP 所導(dǎo)致的凋亡細(xì)胞數(shù)量。對視野下凋亡細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算凋亡指數(shù)，結(jié)果如圖7 所示，與未加精油的對照組相比，上述兩種細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)量隨精油濃度的提高，均顯著增多（P＜0.01），呈明顯的量效關(guān)系。

圖5 紫丁香花精油對MGC80-3 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

圖6 紫丁香花精油對HGC-27 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

圖7 紫丁香花精油誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡情況的統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

精油是指具有芳香氣味的植物揮發(fā)油，研究顯示，植物精油具有抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、健胃、解熱、鎮(zhèn)痛等多種生理活性，成為具有開發(fā)潛力的天然成分［22-26］。與化學(xué)合成的抗氧化劑相比，天然抗氧化劑具有安全、無毒、對人體健康無害等優(yōu)點(diǎn)，而合成的抗氧化劑具有致畸、致癌作用和毒性，因此尋找天然抗氧化劑成為熱點(diǎn)［27-29］。在抗氧化能力的評估中，總抗氧化能力（T-AOC）體現(xiàn)的是樣本中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中常用來檢測各種抗氧化物溶液的綜合抗氧化活性；DPPH 自由基屬于較穩(wěn)定的有機(jī)物自由基，廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的體外抗氧化活性研究，因此分析樣本對DPPH 自由基的清除能力是評估其抗氧化活性的重要方面；羥自由基是體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基，能引起DNA、多糖和細(xì)胞膜的降解，殺傷紅細(xì)胞，導(dǎo)致癌變和衰老等，研究羥自由基的清除能力有利于預(yù)防疾病和衰老［30-33］。大量研究報(bào)道［34-36］，多種精油具有良好的抗氧化活性。李海亮等［37］研究表明芍藥花精油且具有較好的體外抗氧化活性，對DPPH 自由基和ABTS 自由基及對亞油酸脂質(zhì)過氧化具有一定的抑制作用，且抗氧化作用隨著精油質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。王健等［38］報(bào)道紫蘇不同部位精油均具有一定的抗氧化能力，紫蘇葉精油清除DPPH 自由基的能力較強(qiáng)，紫蘇籽精油清除羥自由基的能力較強(qiáng)；權(quán)美平等［39］研究表明茜草精油可作為重要的天然抗氧化劑。本研究以不同體系評價(jià)紫丁香花精油的抗氧化活性，結(jié)果證實(shí)紫丁香花精油具有較好的總抗氧化和清除羥自由基的生物活性，但清除DPPH 的能力相對陽性對照BHT 較弱，表明紫丁香花精油在植物源天然抗氧化劑的開發(fā)方面，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

藥用植物精油的組成復(fù)雜，而且不同植物的精油化學(xué)成分均不同，主要包括萜類、芳香族、脂肪族以及含氮含硫化合物。因此，其抗腫瘤作用機(jī)制也多種多樣。例如Jia 等［40］發(fā)現(xiàn)萜類化合物檸檬烯可以提高Bax 和細(xì)胞色素 C 的含量，降低Bcl-2 的表達(dá)和Akt 等多種蛋白的磷酸化水平，誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞LS174T 凋亡；蔡劍等［41］的研究表明另一種萜類化合物廣藿香醇可能通過增強(qiáng) caspase-3 和Bax的表達(dá)，并下調(diào) Livin 和Bcl-2 的表達(dá)，抑制人前列腺癌細(xì)胞DU145 的增殖；Jaganathan 等［42］證實(shí)芳香族化合物丁香酚能通過活化p53 和caspase-3，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡；戴舒柳等［43］研究認(rèn)為單萜類化合物檸檬醛能夠通過降低細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量，提高氧自由基的水平，抑制人白血病細(xì)胞K562 的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。目前，針對紫丁香有效成分在抗腫瘤方面的研究主要集中于紫丁香苷［44-45］，而關(guān)于紫丁香花精油對腫瘤細(xì)胞的作用，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法獲得紫丁香花精油粗品，利用常見的體外抗氧化能力檢測系統(tǒng)分析精油的抗氧化活性，并通過經(jīng)典的MTT 法和TUNEL 法分析其對兩株胃癌細(xì)胞系增殖和凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫丁香花精油能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞MGC80-3 和HGC-27 的增殖（IC50值分別為0.282 mg/mL 和0.263 mg /mL），并誘導(dǎo)其凋亡，具備較強(qiáng)的抑制作用，表明紫丁香花精油在天然抗腫瘤藥物開發(fā)方面具有一定的研究潛力。然而，需要更加深入的研究，揭示紫丁香花精油的成分組成及其抑制胃癌細(xì)胞的分子機(jī)制，為研制出新的天然抗氧化劑和抗腫瘤藥物開辟新途徑。

4 結(jié)論

利用水蒸氣蒸餾法獲得紫丁香花精油，體外抗氧化實(shí)驗(yàn)顯示其具有較好的DPPH 自由基、羥自由基的清除作用，與精油濃度呈現(xiàn)出量效關(guān)系，并且其總抗氧化能力強(qiáng)于化學(xué)抗氧化劑BHT。此外，紫丁香花精油能顯著抑制胃癌細(xì)胞MGC80-3 和HGC-27 增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。