方冠宇，穆曉靜，蔣予箭*

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

浙江玫瑰醋是江浙一帶的傳統(tǒng)調(diào)味品，有悠久的生產(chǎn)歷史。浙江玫瑰醋在發(fā)酵過程中，沒有人工添加菌種，米飯經(jīng)“發(fā)花”后“沖缸放水”，由于微生物的優(yōu)勝劣汰，在微生物達到平衡的同時，不斷使原料進行糖化、乙醇發(fā)酵、醋酸發(fā)酵以及產(chǎn)生各種風味物質。玫瑰醋在發(fā)酵過程中，風味物質的生成與發(fā)酵過程中微生物群落的代謝活動密切相關。有機酸是玫瑰醋中的重要風味物質，乙酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸等[1-3]不揮發(fā)性有機酸能夠調(diào)和酸味，優(yōu)質食醋中含有較高的不揮發(fā)酸，能夠賦予食醋輕柔的口感[4]。

隨著生物技術的發(fā)展，變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）[5-11]和高通量測序[12-13]等技術被應用于發(fā)酵食品中。發(fā)酵食品中的微生物群落的組成、發(fā)酵過程中的變化[14-17]以及功能[18-20]越來越多地被研究。何同杰[21]利用高通量測序技術研究了酸面團中微生物的多樣性及其風味物質代謝，發(fā)現(xiàn)酸面團中的細菌主要為乳酸桿菌屬且其多樣性比較豐富，酸面團中有機酸主要由乳酸桿菌屬產(chǎn)生，通過添加舊金山乳酸桿菌，酸面團中的有機酸及揮發(fā)性風味物質可以顯著提高。牟穰[22]對清爽型黃酒釀造微生物群落結構及其與風味物質相關性進行了研究，發(fā)現(xiàn)在黃酒發(fā)酵過程中醋酸桿菌屬、乳酸桿菌屬與草酸、酒石酸具有較高的相關性，這與浙江玫瑰醋發(fā)酵過程中乳酸桿菌屬與草酸、酒石酸具有負相關性不同。許偉[23]采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）-DGGE技術和克隆文庫分析方法研究了鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過程中微生物群落結構，除獲得幾種常見的醋酸菌之外，還得到了較多種類的乳酸菌。王宗敏[24]對鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過程中菌群結構變化與風味物質組成之間的相關性進行了研究，發(fā)現(xiàn)醋酸桿菌屬與乳酸桿菌屬在鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵過程中起著主要作用，并且隨著發(fā)酵進行醋酸桿菌屬相對豐度上升，乳酸桿菌屬相對豐度下降，這與浙江玫瑰醋發(fā)酵主發(fā)酵過程情況一致。

浙江玫瑰醋以秈米為原料，進行浸泡、蒸煮后，在陶缸內(nèi)搭窩，依靠空氣中的霉菌掉落在米飯表面，對淀粉進行糖化，這個過程稱為“發(fā)花”。糖化結束之后，在陶缸內(nèi)加水進行乙醇發(fā)酵和醋酸發(fā)酵稱為“沖缸放水”。當發(fā)酵液的總酸含量不再上升時，加入發(fā)酵液質量3%的NaCl終止發(fā)酵。本研究采用高通量測序技術，對“沖缸放水”后的玫瑰醋細菌群落變化進行分析，并用高效液相色譜對發(fā)酵過程中玫瑰醋有機酸含量進行測定。采用雙向正交偏最小二乘（bidirectiona orthogonal partial least squares，O2PLS）法對細菌群落數(shù)據(jù)集和有機酸含量數(shù)據(jù)集之間的相關性進行數(shù)據(jù)分析和挖掘，找到與有機酸變化高度相關的細菌種類，為找尋玫瑰醋發(fā)酵過程中的功能微生物提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中晚秈米為安徽滁州產(chǎn)。

磷酸二氫銨、磷酸均為分析純；有機酸標準樣品：乳酸、丙酸、甲酸、乙酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸、L-酒石酸、α-酮戊二酸、草酸（純度＞99%）；土壤DNA提取試劑盒 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設備

TGW16臺式高速微量離心機 上海中科生物醫(yī)學高科技開發(fā)有限公司；LC-2010AHT高效液相色譜儀日本島津公司；無菌注射器 新蘇醫(yī)療器械有限公司；UPWS-1-60D超純水設備 杭州永潔達凈化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 浙江玫瑰醋釀造工藝

秈米100 kg浸泡7 d（每2 d換1 次水）。常壓蒸飯30 min，將蒸熟的米飯自然冷卻，放入500 kg的陶缸中，將米飯搭成窩狀。空氣中的微生物進入米飯中，使米飯?zhí)腔．旓埜C內(nèi)出現(xiàn)糖液時，每天將糖液回澆在米飯表面1 次。當飯窩里的糖液高度達到米飯高度的4/5時（米飯放入陶缸后15 d左右），向陶缸內(nèi)加入300 kg水進行發(fā)酵。在此過程中需要定期對發(fā)酵液進行攪動，散發(fā)發(fā)酵產(chǎn)生的熱量、通入氧氣以及使物料混合均勻。當發(fā)酵液的酸度不再升高時（加水后4 個月左右），向發(fā)酵液中加入質量分數(shù)3%的NaCl終止發(fā)酵。再在缸口用塑料膜密封，陳釀1 個月。

1.3.2 取樣

玫瑰醋“沖缸放水”后，分別在第0（“沖缸放水”當天）、10、20天……第90天分別取樣，取樣時先將發(fā)酵液混合均勻。

1.3.3 高通量測序

按照土壤DNA提取試劑盒說明書對醋樣中微生物DNA進行提取。將提取合格的DNA送上海派森諾生物科技股份有限公司進行個通量測序。測序平臺：MiSeq；測序區(qū)域：細菌V4區(qū)。

1.3.4 有機酸測定

高效液相色譜條件：色譜柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：5%甲醇-95%磷酸二氫銨（6 g/L；pH 2.60）；流速：0.8 mL/min；進樣體積：5 μL；柱溫：30 ℃；紫外檢測器，檢測波長：210 nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

主要利用O2PLS法[25]對玫瑰醋“沖缸放水”后發(fā)酵過程中的微生物與風味物質之間的相關性進行分析。該方法是傳統(tǒng)偏最小二乘法的延伸，是一種采用潛變量技術進行回歸的分析方法[26]。O2PLS的基本原理如圖1所示，O2PLS將X和Y變量總共分為3 個部分：i）X和Y彼此相關的變量；ii）X與Y不相關的變量；iii）Y與X不相關的變量。第ii部分和第iii部分變量分別可以再分為兩個部分：ii-1）相當于正交偏最小二乘（orthogonal partial least squares，OPLS）法的成分（orthogonal in X（OPLS），orthogonal in Y（OPLS）），該部分會對O2PLS模型的預測和解釋有貢獻；ii-2）相當于主成分分析（principal components analysis，PCA）的成分（orthogonal in X（PCA），orthogonal in Y（PCA）），該部分不會影響O2PLS模型的預測功能，但是可以改善模型的解釋能力。

圖1 O2PLS的基本原理Fig. 1 Schematic demonstration of O2PLS model

通過上面對O2PLS方法的模型分解，可以用下面的公式表達O2PLS：

式中：lX′和lY′分別表示X與Y不相關變量、Y與X不相關變量，l表示得分值；TP’和UQ’表示X與Y相關部分的變量，T和U表示得分值，P’和Q’表示載荷值，得分值與載荷值都通過交叉檢驗確定；ToPo’和UoQo’表示X與Y不相關部分的變量，To和Uo表示得分值，Po’和Qo’表示載荷值；E和F分別表示X和Y的殘差。

用軟件Simca-p的分析步驟如下：1）輸入數(shù)據(jù)集，定義變量性質：玫瑰醋發(fā)酵時間為觀測變量共10 個；細菌相對豐度數(shù)據(jù)集為自變量（X）共100 個（相對豐度前100 個屬）；有機酸數(shù)據(jù)為因變量Y共有10 個，定義結束后建立模型。2）指定O2PLS模型，進行擬合。3）分析擬合結果，評價模型效果，Simca-p提供了豐富的圖示功能，可以繪制各類圖形，根據(jù)圖表結果發(fā)現(xiàn)特異點，確定模型的精度要求。4）通過相關性矩陣以及各個統(tǒng)計量尋找分析每個有機酸與細菌之間的相關關系。

2 結果與分析

2.1 玫瑰醋發(fā)酵過程中細菌菌群變化

2.1.1 玫瑰醋發(fā)酵過程中細菌門水平變化

圖2 0 d醋樣門水平細菌群落結構Fig. 2 Relative abundances of major bacterial phyla in vinegar sample on day 0

圖3 玫瑰醋發(fā)酵過程中門水平細菌相對豐度變化Fig. 3 Changes in relative abundances of major bacterial phyla during the fermentation of Zhejiang rosy vinegar

由于第0天為玫瑰醋剛“沖缸放水”后的樣品，因此0 d樣品中的微生物全部來自于玫瑰醋“發(fā)花”過程，其門水平的細菌菌群結構見圖2。第0天的樣品中總共檢測出5 個門。分別為變形菌門（Proteobacteria，40.65%）、厚壁菌門（Firmicutes，55.09%）、放線菌門（Actinobacteria，4.04%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，0.21%）、梭桿菌門（Fusobacteria，0.011%）。這些細菌與欒同青[27]研究的黃酒中細菌種類一致，也與浙江玫瑰醋在“沖缸放水”后主要先進行乙醇發(fā)酵的實際情況相符。

玫瑰醋發(fā)酵過程中，總共檢測到25 個門。對浙江玫瑰醋發(fā)酵不同時間發(fā)酵液中的細菌群落結構進行分析，如圖3所示，變形菌門和厚壁菌門在整個玫瑰醋發(fā)酵過程中占絕對優(yōu)勢，其相對豐度之和大于95%。在發(fā)酵過程中，除早期發(fā)酵（0～10 d）變形菌門相對豐度略微降低，厚壁菌門的豐度略微增加外。其他發(fā)酵階段，變形菌門相對豐度持續(xù)升高，而厚壁菌門相對豐度持續(xù)降低。這是由于玫瑰醋的前期發(fā)酵為乙醇發(fā)酵，到發(fā)酵第7天左右，發(fā)酵液中的乙醇體積分數(shù)達到最高，后面的發(fā)酵以醋酸發(fā)酵為主導。直到80～90 d，厚壁菌門的相對豐都接近0，變形菌門的相對豐度達到最高，兩者趨于穩(wěn)定。說明玫瑰醋在發(fā)酵過程中變形菌門起主導作用。在整個發(fā)酵過程中放線菌門和擬桿菌門一直存在，但是相對豐度很低。

2.1.2 玫瑰醋發(fā)酵過程中細菌屬水平變化

由于在提取基因組時，人體、空氣等外界環(huán)境也會因人員操作而帶入微生物，在擴增及測序環(huán)節(jié)使外界環(huán)境微生物與樣品微生物一起被測出。為排除人為操作以及測序時機器讀取誤差，保證測定結果的準確性，本研究僅對相對豐度不小于1%的細菌屬進行分析。

圖4 玫瑰醋釀造過程中主要細菌屬相對豐度變化Fig. 4 Changes in relative abundances of major bacterial genera during the fermentation of rosy vinegar

浙江玫瑰醋是對傳統(tǒng)工藝特色保留比較完整的一種調(diào)味品，其純粹依靠空氣中多種微生物在煮熟的米飯中生長、繁殖，通過菌群的優(yōu)勝劣汰，在達到微生物平衡的同時，使淀粉物質不斷液化、糖化、酒化、醋化等過程。由圖4可以看出，玫瑰醋在“沖缸放水”后，醋醪中的細菌的演替過程。除去第0天的樣品，醋醪中的醋酸桿菌屬（Acetobacter）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的豐度達到80%以上。說明玫瑰醋在發(fā)酵過程中醋酸桿菌屬和乳酸桿菌屬起主導作用。在“沖缸放水”后的1 周時間里，玫瑰醋主要進行乙醇發(fā)酵，在第7天左右，醋醪的乙醇體積分數(shù)達到最高值，而后主要進行醋酸發(fā)酵，因此在10 d以后醋酸桿菌的相對豐度呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，在第60天其豐度達到最高，60 d后醋酸桿菌屬的相對豐度出現(xiàn)波動，說明醋酸桿菌屬的豐度達到平衡。在發(fā)酵過程中乳酸桿菌屬的相對豐度呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，這是由于玫瑰醋在發(fā)酵過程中，不斷對發(fā)酵液中的糖分進行消耗，發(fā)酵液的pH值也不斷降低，對醋酸桿菌屬產(chǎn)生了抑制作用。玫瑰醋的發(fā)酵過程無人工添加菌種，由于米飯表面很適宜霉菌生長，因此“發(fā)花”過程中，大量霉菌在米飯表面生長繁殖使米飯充分糖化?！皼_缸放水”后，隨著糖分濃度的降低，細菌會迅速繁殖，但由于適宜的糖濃度乙醇發(fā)酵很迅速，在發(fā)酵第7天時，乙醇體積分數(shù)達到了最高值7%左右（圖5）。因此隨著乙醇體積分數(shù)的升高不耐乙醇的細菌消失，醋酸桿菌屬等細菌迅速繁殖進行醋酸發(fā)酵。玫瑰醋為靜態(tài)表面發(fā)酵，其主要的發(fā)酵過程集中在發(fā)酵液表面，由于發(fā)酵產(chǎn)熱，發(fā)酵液表面的溫度最高可達40 ℃左右，這種高溫使不耐熱的細菌不易生長。玫瑰醋發(fā)酵只有液面接觸氧氣，液面以下的發(fā)酵液隔絕氧氣，適合一些厭氧或兼性厭氧菌的生長，因此醋醪中乳酸桿菌屬的相對豐度較高。隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分消耗以及pH值持續(xù)下降，許多不耐酸細菌就會消失。經(jīng)過醋醪環(huán)境的多重選擇，醋醪中的微生物趨于穩(wěn)定，這種現(xiàn)象可以看做微生物的“自我凈化”。

圖5 浙江玫瑰醋發(fā)酵過程中乙醇體積分數(shù)變化Fig. 5 Change in alcohol content during the fermentation of Zhejiang rosy vinegar

經(jīng)過細菌對環(huán)境的適應與平衡，醋醪中的微生物趨于穩(wěn)定。除相對豐度較高的醋酸桿菌屬和乳酸桿菌屬外，還有一些相對豐度較低的細菌能夠適應醋醪環(huán)境一直存在與整個發(fā)酵過程中，如腸球菌屬（Enterococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、鏈球菌屬（Streptococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）。這與固態(tài)發(fā)酵醋的細菌種類有所差異，固態(tài)發(fā)酵醋發(fā)酵過程中，細菌除醋酸桿菌屬和乳酸桿菌屬外，其他細菌為乳球菌屬、葡糖醋酸桿菌屬、腸球菌屬、黃單胞桿菌屬和芽孢桿菌屬[24]。除醋酸桿菌和乳酸桿菌屬外，腸球菌屬和芽孢桿菌屬在兩種醋的發(fā)酵過程中都存在。其中，芽孢桿菌屬雖然豐度很低，但它們對風味物質的形成起著重要的作用[28]。有研究表明[29]，假單胞菌可以川芎嗪以及其合成前體2,3-丁二酮、3-羥基丁酮。假單胞菌屬和不動桿菌屬在黃酒發(fā)酵過程中有檢出[22]，這兩種菌在玫瑰醋中檢出可能是由于玫瑰醋前期發(fā)酵主要為乙醇發(fā)酵，類似于黃酒發(fā)酵過程。

2.2 玫瑰醋發(fā)酵過程中有機酸組成

2.2.1 玫瑰醋發(fā)酵過程中有機酸含量變化

圖6 玫瑰醋發(fā)酵過程中有機酸含量變化Fig. 6 Changes in organic acid contents in rosy vinegar during fermentation

用高效液相色譜法對發(fā)酵過程中玫瑰醋樣品的9 種有機酸含量進行測定，結果見圖6。在整個玫瑰醋的發(fā)酵過程中，有機酸含量呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，在80～90 d，有機酸含量略微下降，說明玫瑰醋發(fā)酵基本結束。在第0天時，有機酸質量濃度高達37.60 g/L，乳酸質量濃度高達22.44 g/L，說明在玫瑰醋的“發(fā)花”階段積累了大量有機酸。乳酸含量除在前期發(fā)酵（0～10 d）略微上升外，在發(fā)酵過程中一直呈現(xiàn)下降趨勢。乳酸主要在3 個過程中產(chǎn)生：1）大米在浸泡過程；2）“發(fā)花”過程；3）早期發(fā)酵過程。大米在浸泡的過程中由于乳酸菌等微生物的作用，產(chǎn)生大量乳酸。“發(fā)花”過程中自然培養(yǎng)生成的紅曲霉、根霉和毛霉等是玫瑰醋中生成乳酸的主要原料來源，其余是由乙醇發(fā)酵環(huán)節(jié)的密閉發(fā)酵期或醋酸發(fā)酵環(huán)節(jié)后期的米醋發(fā)酵醪中乳酸桿菌和鏈球菌作用而生成，除此之外，有些種類的乳酸菌能將丙酮酸作為受氫體而生成乳酸[30]。乙酸含量隨著發(fā)酵的進行，一直呈現(xiàn)上升的趨勢。乙酸和乳酸含量占有機酸總量的比例最高，在整個發(fā)酵過程中，乙酸和乳酸含量達到有機酸總量的90%左右，說明乙酸和乳酸為玫瑰醋的主要有機酸。蘋果酸、α-酮戊二酸和草酸基本上都是在“發(fā)花”過程產(chǎn)生，在發(fā)酵過程中含量變化不大。酒石酸、焦谷氨酸和丙酮酸在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)緩慢上升趨勢。除乙酸、乳酸外的7 種有機酸（丙酮酸、草酸、α-酮戊二酸、焦谷氨酸、酒石酸、琥珀酸、蘋果酸）含量在總有機酸含量中占比很低，但大部分還是由“發(fā)花”過程產(chǎn)生。這些有機酸大部分是三羧酸循環(huán)途徑的中間代謝物，在生成的同時也被作為其他代謝途徑的前體進入更為復雜的代謝途徑，所以其在醋酸發(fā)酵過程中不會有大量的積累。

2.2.2 玫瑰醋發(fā)酵過程中有機酸含量PCA和聚類分析

圖7 玫瑰醋發(fā)酵過程中有機酸含量PCAFig. 7 PCA of organic acid contents during rosy vinegar fermentation

根據(jù)PCA得分值和載荷值，可以得到每個發(fā)酵階段對應的物質種類。由圖7可以看出，有機酸含量基本呈現(xiàn)向第1主成分正向變化。在發(fā)酵初期，玫瑰醋中主要的呈味有機酸為乳酸。發(fā)酵后期呈味有機酸比較豐富，主要的呈味有機酸有乙酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸、焦谷氨酸、酒石酸。這與玫瑰醋有機酸變化含量變化規(guī)律相符，在發(fā)酵后期，有機酸含量基本達到最高，呈味有機酸比較更豐富。由圖8可以看出，玫瑰醋發(fā)酵過程中有機酸含量的聚類分析結果與PCA結果相似。聚類分析主要將玫瑰醋發(fā)酵過程中有機酸含量分為發(fā)酵前期、發(fā)酵中期和發(fā)酵后期3大類。在發(fā)酵中期，20 d和30 d的玫瑰醋樣品有機酸含量可以聚為一個小類，50 d和60 d的玫瑰醋樣品有機酸含量可以聚為一個小類。這與玫瑰醋發(fā)酵過程中有機酸含量的PCA結果相符。

圖8 玫瑰醋發(fā)酵過程中有機酸含量聚類分析Fig. 8 HCA analysis of organic acid contents in rosy vinegar during fermentation

2.3 玫瑰醋發(fā)酵過程與有機酸相關細菌分析

2.3.1 與有機酸相關的細菌重要性指標（variable importance for the projection，VIP）分析

圖9 與有機酸相關的VIP分析Fig. 9 VIP plot of the important bacteria correlated with organic acids

利用O2PLS模型對細菌相對豐度與有機酸含量進行相關性分析，可以得出X變量（細菌的相對豐度）與Y變量（有機酸含量）相關性的自變量重要性指標（VIP（pred））。由圖9可以看出，細菌的VIP（pred）在0.15～1.50之間。VIP（pred）大于1.4的有6 個屬，VIP（pred）值在1.3～1.4之間有5 個屬，VIP（pred）值在1.2～1.3之間有4 個屬，VIP（pred）值在1.1～1.2之間有3 個屬，VIP（pred）值在1.0～1.1之間有5 個屬。其中醋桿菌屬、乳桿菌屬與有機酸相關重要性最高。選取VIP（pred）大于1的23 個細菌屬進行與有機酸相關性分析。

2.3.2 玫瑰醋發(fā)酵過程中與有機酸相關的細菌分析

選取VIP（pred）大于1的細菌（屬）與有機酸進行相關性分析，將有機酸與細菌的相關性系數(shù)做成Heatmap圖。由圖10可知，與乙酸呈現(xiàn)正相關的細菌有7 個屬，負相關16 個屬，與乙酸呈現(xiàn)最高正相關性的細菌有醋酸桿菌屬；與乳酸呈現(xiàn)正相關的細菌有16 個屬，負相關細菌7 個屬，與乳酸呈現(xiàn)最高正相關性的細菌為乳酸桿菌屬；與蘋果酸呈現(xiàn)正相關的細菌有13 個屬，負相關細菌10 個屬，與蘋果酸呈現(xiàn)最高正相關的細菌為梭桿菌屬；與琥珀酸呈現(xiàn)正相關性的細菌有9 個屬，呈現(xiàn)負相關細菌14 個屬，與琥珀酸呈現(xiàn)最高正相關的細菌為醋酸桿菌屬；與酒石酸呈現(xiàn)正相關性的細菌有7 個屬，呈現(xiàn)負相關性細菌16 個屬，與酒石酸呈現(xiàn)最高正相關細菌為醋酸桿菌屬；與α-酮戊二酸呈現(xiàn)正相關的細菌有12 個屬，呈現(xiàn)負相關性細菌11 個屬，與α-酮戊二酸呈現(xiàn)最高正相關性細菌為[Eubacterium]_rectale_group；與草酸呈現(xiàn)正相關細菌有9 個屬，呈現(xiàn)負相關性細菌有14 個屬，與草酸呈現(xiàn)最高正相關性細菌為醋酸桿菌屬；與丙酮酸呈現(xiàn)正相關的細菌有6 個屬，呈現(xiàn)負相關細菌有17 個屬，呈現(xiàn)最高正相關的細菌為醋酸桿菌屬；與焦谷氨酸呈現(xiàn)正相關的細菌有6 個屬，呈現(xiàn)負相關的細菌有17 個屬，與焦谷氨酸呈現(xiàn)最高正相關細菌為醋酸桿菌屬。

圖10 細菌與有機酸相關性系數(shù)HeatmapFig. 10 Heatmap for correlation coefficients between bacteria and organic acids

表1 與有機酸相關性系數(shù)|ρ|大于0.6的細菌Table 1 Bacteria showing correlation coef ficients with organic acids greater than 0.6

表1為與有機酸的相關性系數(shù)|ρ|大于0.6的細菌屬，這些細菌與有機酸具有較好的相關性?？梢钥闯?，醋酸桿菌屬除與蘋果酸和α-酮戊二酸的相關性（|ρ|）小于0.6外，與其他有機酸的相關性均大于0.6。醋酸桿菌屬與乙酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、丙酮酸、焦谷氨酸均具有較好的正相關性，與乳酸具有較高的負相關性，說明醋酸桿菌屬在玫瑰醋發(fā)酵過程中對有機酸的產(chǎn)生具有重要作用。在浙江玫瑰醋發(fā)酵過程中，醋酸菌中的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶能夠將乙醇氧化成乙酸，因此醋酸菌與乙酸具有很高的相關性。有研究表明醋酸菌可以利用碳源產(chǎn)生酒石酸、琥珀酸等有機酸，因此醋酸桿菌屬與這些有機酸也具有較高的相關性。由于發(fā)酵初期，發(fā)酵液中積累了大量“發(fā)花”過程產(chǎn)生的糖類物質，而玫瑰醋發(fā)酵過程中只有液面表面與空氣接觸，乳酸菌可以利用糖類進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，在發(fā)酵初期積累了大量乳酸，因此乳酸桿菌屬、乳球菌屬等細菌與乳酸高度正相關。但隨著發(fā)酵進行，由于乙醇發(fā)酵以及pH值下降等原因，會抑制乳酸菌的生長，而醋酸菌會迅速繁殖，乳酸可以作為碳源被醋酸菌利用，因此醋酸菌與乳酸負相關。除乙酸和乳酸外的其他有機酸（蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、α-酮戊二酸、草酸、丙酮酸和焦谷氨酸）大部分為微生物的丙酮酸或三羧酸循環(huán)的產(chǎn)物，在生成的同時也被作為其他代謝途徑的前體進入更為復雜的代謝途徑，所以其在醋酸發(fā)酵過程中不會有大量的積累。因此從圖3～8可以看出，這些有機酸與細菌的相關性低于乙酸和乳酸與細菌的相關性。

3 結 論

通過對浙江玫瑰醋發(fā)酵過程中細菌菌群相對豐度以及有機酸含量的測定，并用O2PLS對細菌與有機酸進行相關性分析，得出了浙江玫瑰醋在“沖缸放水”后的發(fā)酵過程中與有機酸相關性較強的功能細菌。利用O2PLS模型對細菌相對豐度與有機酸含量進行相關性分析，可以得出X變量（細菌相對豐度）與Y變量（有機酸含量）相關性的自變量重要性指標（VIP（pred））大于1的細菌有醋酸桿菌屬、乳桿菌屬、甲基桿菌屬等；選取VIP（pred）大于1的細菌與有機酸進行相關性分析，得到了細菌與有機酸的相關性Heatmap，并得出了與各種有機酸相關性系數(shù)|ρ|大于0.6的細菌屬，以及與有機酸具有較強正、負相關性的細菌屬。例如醋酸桿菌屬、瘤胃球菌屬、海洋桿菌屬與乙酸具有較好的正相關性；乳桿菌屬、乳球菌屬、另枝菌屬、不動桿菌屬、水小桿菌屬等細菌與乳酸具有較好的正相關性。結果為找尋玫瑰醋發(fā)酵過程中的功能微生物，提升玫瑰醋品質提供數(shù)據(jù)支持。