唐 霄，孫楊贏*，江雪婷，潘道東，鄭蘭亭，曹錦軒

（寧波大學(xué) 浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315800）

鵝肉是人們喜愛的禽肉之一，具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇等特點(diǎn)，備受人們青睞，其營(yíng)養(yǎng)豐富均衡、氨基酸組成合理，是制備呈味肽的理想優(yōu)質(zhì)蛋白原料。呈味肽是增強(qiáng)食品原有風(fēng)味的肽類物質(zhì)，包括酸、苦、甜、鮮和咸味[1-2]，由于其安全性高、吸收性強(qiáng)的特點(diǎn)，在食品加工工業(yè)中逐漸得到應(yīng)用。苗曉丹等[3]采用中性蛋白酶制備河豚呈味肽，所得酶解液鮮味突出，較好地保留了暗紋東方鲀?nèi)鉁珴夂瘛⒊志玫母杏X。陶正清等[4]對(duì)鹽水鴨水提物中的小分子肽進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，發(fā)現(xiàn)了3 條可能產(chǎn)生鮮味、甜味和濃厚感呈味肽，對(duì)鹽水鴨的滋味有一定的貢獻(xiàn)。李靜等[5]利用低值蝦制備呈味肽，研究了復(fù)合蛋白酶的酶解工藝，在最佳條件下，短肽（360～1 000 Da）得率達(dá)到42.93%，且風(fēng)味良好。而目前鵝肉的研究主要集中在具有生理活性的抗氧化肽生產(chǎn)、水解工藝的優(yōu)化等[6-7]，利用鵝肉制備呈味肽的研究較少。

蛋白質(zhì)酶水解有助于改善食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性，陳怡穎等[8]對(duì)比分析了酶解液與雞湯中游離氨基酸的組成及含量，發(fā)現(xiàn)酶解液中的游離氨基酸總含量相對(duì)雞湯顯著增加。中性蛋白酶是一類在中性條件下作用于蛋白質(zhì)肽鍵的蛋白酶，其作用條件溫和、水解度高、風(fēng)味佳，已廣泛用于生產(chǎn)高級(jí)調(diào)味品和食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，各種動(dòng)物來(lái)源性抽提物生產(chǎn)功能性骨、水產(chǎn)提取物、肽等及研究開發(fā)一些高附加值的功能食品[9]，堿性蛋白酶是一類最適作用pH值為堿性的蛋白酶，可水解肽鍵、酯鍵、酰胺鍵，在食品行業(yè)可水解動(dòng)植物蛋白[10]。風(fēng)味蛋白酶為由米曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的具備活性的酶，它能用于食品風(fēng)味的改良[11]。此外，木瓜蛋白酶對(duì)許多蛋白質(zhì)都有水解作用，具備酶活性高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點(diǎn)，是一種廣泛應(yīng)用的商業(yè)酶[12]。這4 種酶在食品風(fēng)味及品質(zhì)調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用。

本研究以鵝肉為原料，選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶，以水解度、寡肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、感官評(píng)定和游離氨基酸的變化為依據(jù)，通過(guò)電子舌進(jìn)一步確定呈味作用，研究不同種類的蛋白酶對(duì)鵝肉酶解制備呈味肽的影響，以期選出在相應(yīng)條件下最適宜制備呈味肽的蛋白酶，對(duì)鵝肉滋味研究系統(tǒng)進(jìn)行完善，為開發(fā)富含呈味肽的營(yíng)養(yǎng)功能型鵝肉調(diào)味料提供重要的理論基礎(chǔ)，為推動(dòng)鵝肉精深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)鵝肉加工副產(chǎn)物的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 只冷凍鵝分2 批次購(gòu)自寧波清水浦市場(chǎng)，將其放入裝有冰袋的箱子，0.5 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行解凍。

中性蛋白酶（5×104U/g）、堿性蛋白酶（2×105U/g）、風(fēng)味蛋白酶（15×106U/g）、木瓜蛋白酶（1×105U/g）（均為食品級(jí)） 北京索萊寶科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、檸檬酸均為國(guó)產(chǎn)分析純；茚三酮、氨基酸分析用緩沖液（均為色譜純） 百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WJWX-A500型高速多功能粉碎機(jī) 上海緣沃工貿(mào)有限公司；XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；KDN-16C數(shù)顯溫控消化爐 上海新嘉電子有限公司；Centrifuge 5804R離心機(jī) 艾本德中國(guó)有限公司；Smartongue電子舌 上海瑞玢國(guó)際貿(mào)易有限公司；Infinite 200 Pro全波長(zhǎng)掃描多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；L-3000型全自動(dòng)氨基酸分析儀 蘇州華美辰儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將冷凍鵝肉裝于保鮮袋后浸泡在4 ℃水中進(jìn)行解凍，解凍完畢后用大量清水洗凈，剔除所有鵝骨、鵝肉表面脂肪，將鵝肉剪成0.5 cm×2 cm×2 cm的小塊，用高速多功能粉碎機(jī)進(jìn)行多次重復(fù)攪碎得到鵝肉糜，置于保鮮密封袋中放入-20 ℃冰箱凍藏備用，貯藏期限20 d內(nèi)。

1.3.2 鵝肉蛋白酶解液的制備

稱取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的鵝肉糜125 g置于500 mL的燒杯中，按固液比1∶3（g/mL）加水，冰浴勻漿（10 000 r/min，3×30 s），將勻漿好的鵝肉用1 mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)pH值至各蛋白酶的最適pH值，然后在恒溫水浴鍋中45 ℃預(yù)熱15 min，加入蛋白酶，在45 ℃恒溫酶解6.5 h，酶解完畢后于100 ℃水浴加熱10 min進(jìn)行滅酶，冷卻到室溫，4 500 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清液備用。4 種蛋白酶酶解條件見表1。

表1 4 種蛋白酶酶解鵝肉條件Table 1 Conditions for hydrolysis of goose meat by four proteases

1.3.3 總氮含量的測(cè)定

采用凱氏定氮法[13]。

1.3.4 水解度的測(cè)定

采用甲醛電位滴定法測(cè)定上清液氨基態(tài)氮含量，采用甲醛電位滴定法測(cè)定上清液氨基態(tài)氮含量，凱氏定氮法測(cè)定總氮含量，按照下式計(jì)算水解度[14]：

式中：V1為滴定樣品時(shí)消耗標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液體積/mL；V2為滴定空白時(shí)消耗標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液體積/mL；C為滴定時(shí)標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液濃度/（mol/L）；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.5 寡肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

小分子肽含量采用三氯乙酸法[15]，量取10 mL酶解液，加入10 mL 20%三氯乙酸溶液，混合均勻，靜置10 min。將樣品溶液4 000 r/min離心10 min，測(cè)上清液總氮含量，用以表示酶解液中小分子肽含量。

1.3.6 氨基酸成分分析

1.3.6.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確稱取氨基酸混合標(biāo)樣76.83 mg，用超純水定容至100 mL，即得2.5 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。從中準(zhǔn)確移取2 mL混合溶液，加入2 mL含有多種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸組分（2.5 μmol/mL）的混合液，用超純水定容至50 mL，即為0.10 μmol/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.6.2 氨基酸分析程序與條件[16]

氨基酸自動(dòng)分析儀參數(shù)條件：分離柱（4.6 mm×60 mm），樹脂為陽(yáng)離子交換樹脂；分離柱溫度57 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm（脯氨酸為440 nm）；進(jìn)樣量20 μL；緩沖液流速0.35 mL/min；反應(yīng)液茚三酮試劑，流速0.35 mL/min；單元溫度135 ℃；使用自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，樣品中氨基酸含量以mg/100 g表示。

1.3.7 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)小組由經(jīng)過(guò)篩選和專業(yè)培訓(xùn)的年齡介于20～25 歲之間的10 名感官評(píng)價(jià)員所組成，4 名男性、6 名女性。評(píng)價(jià)員分別對(duì)按1∶7比例稀釋過(guò)后，溫度保持在35 ℃左右的4 種鵝肉酶解液進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)分采取5 分制[17]，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 鵝肉酶解液的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of goose meat hydrolysates

1.3.8 電子舌測(cè)定滋味輪廓

Smartongue電子舌系統(tǒng)，由6 根化學(xué)傳感器陣列組成，能對(duì)酸味、咸味、鮮味等具有專一響應(yīng)性。在測(cè)定4 種蛋白酶解液的滋味輪廓前，需對(duì)4 種酶解液進(jìn)行稀釋（用純凈水按1∶7比例），每個(gè)樣品測(cè)定7 次。用NaCl（代表咸味）和谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）（代表鮮味）分別配成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液（0.1 mg/mL MSG、0.2 mg/mL MSG、0.3 mg/mL MSG、0.1 mg/mL NaCl、0.2 mg/mL NaCl、0.3 mg/mL NaCl）。此外，分別用0.1、0.2、0.3 mg/mL NaCl和0.1、0.2、0.3 mg/mL MSG配成對(duì)應(yīng)的混合液（0.1 mg/mL（MSG＋NaCl）、0.2 mg/mL（MSG＋NaCl）、0.3 mg/mL（MSG＋NaCl））作為參照的標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液[18]，測(cè)量前對(duì)電子舌進(jìn)行自檢、活化、校準(zhǔn)和診斷等步驟，以確保采集所得數(shù)據(jù)的可靠性和穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的方差分析和顯著性檢驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3 次，采用Origin 8.0制圖。電子舌采集數(shù)據(jù)根據(jù)系統(tǒng)自帶軟件AlphaSoft進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類對(duì)鵝肉酶解液的水解度、寡肽及氨基酸含量的影響

表3 不同鵝肉酶解液對(duì)應(yīng)的水解度和寡肽含量Table 3 Hydrolysis degrees and oligopeptides content of different goose meat hydrolysates

如表3所示，木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度最大，為31.41%。其次是中性蛋白酶及堿性蛋白酶，而風(fēng)味蛋白酶的水解效果最差，僅為7.97%。在相同的酶解條件下，不同蛋白酶對(duì)鵝肉蛋白酶解效果不同，這主要是由酶的專一性所決定，酶的專一性決定它只能作用于某些特定的位點(diǎn)，所以即使是同樣的底物，不同酶的水解效果會(huì)有所不同[19]。此外，木瓜蛋白酶酶解液的水解度大可能與其內(nèi)切酶特性和風(fēng)味酶的外切酶特性有關(guān)，內(nèi)切酶可以直接作用于蛋白質(zhì)肽鏈的中間位點(diǎn)，而風(fēng)味蛋白酶是外切酶，外切酶只有從蛋白質(zhì)肽鏈的兩端酶解，缺乏足夠多的端點(diǎn)，風(fēng)味酶酶解產(chǎn)物的水解度較低[20-21]。因此，在水解度中風(fēng)味蛋白酶與其他酶差別大于寡肽和氨基酸部分。其他3 種酶制備鵝肉呈味肽的效果明顯優(yōu)于風(fēng)味蛋白酶。

木瓜蛋白酶酶解液中寡肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為0.22%，此蛋白酶的活性位點(diǎn)能與底物充分接觸，使底物充分酶解。其次中性蛋白酶酶解液中寡肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，為0.18%，中性蛋白酶的酶解效果強(qiáng)于堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。在酶解過(guò)程中，鵝肉蛋白逐漸被水解為小分子肽及游離氨基酸[22]。因此，酶解液中寡肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)也能反映蛋白酶水解效果的高低，含量高的酶解效果佳。酶解過(guò)程中產(chǎn)生的肽類物質(zhì)對(duì)酶解液風(fēng)味的影響，主要是部分寡肽與其他呈味物質(zhì)發(fā)生協(xié)同作用，使酶解液風(fēng)味飽滿、口感協(xié)調(diào)。寡肽一般由2～6 個(gè)氨基酸組成，一般來(lái)說(shuō)，寡肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的酶解液，其呈味肽的含量也可能相應(yīng)較高[23-24]。根據(jù)水解度和寡肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異，說(shuō)明中性蛋白酶、木瓜蛋白酶制備鵝肉呈味肽的效果明顯優(yōu)于堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。

表4 4 種鵝肉酶解液中氨基酸組成Table 4 Free amino acid compositions of four goose meat hydrolysates mg/100 g

游離氨基酸具有呈味閾值低、呈味能力強(qiáng)的特點(diǎn)，同時(shí)富有酸、甜、苦、咸、鮮5 種基本味感，其含量和種類會(huì)直接影響體系的整體風(fēng)味[25]。由表4可知，鵝肉酶解液中游離氨基酸種類及含量豐富。中性蛋白酶酶解液中游離氨基酸總量最高為1 287 mg/100 g，其次是堿性蛋白酶酶解液和木瓜蛋白酶，分別為1 018、930 mg/100 g，而風(fēng)味蛋白酶酶解液中游離氨基酸總量最低為489 mg/100 g，其酶的水解能力最差?？偟膩?lái)說(shuō)，制備所得酶解液中的游離氨基酸能賦予食物特定的味感，為Maillard反應(yīng)制備熱反應(yīng)型肉味香精提供底物[26-27]。

經(jīng)不同蛋白酶酶解后，4 種酶解液中游離氨基酸含量最高的為亮氨酸，其中堿性蛋白酶酶解液中的苯丙氨酸和亮氨酸含量相同，為140 mg/100 g，它們均為苦味氨基酸。Lioe等[28]研究發(fā)現(xiàn)苦味氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸，其含量低于呈味閾值時(shí)可增強(qiáng)其他氨基酸的鮮味和甜味。酶解液中對(duì)鮮味和甜味有重要作用的氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和脯氨酸總量很高，其中谷氨酸和天冬氨酸是主要的鮮味氨基酸，具有形成肉鮮味和緩沖咸味等味道的特殊功效[29-30]，而甘氨酸除本身提供的清香甜味外，還能減少苦味，從食物中除去不愉快的口味[31]。鵝肉酶解液中鮮甜呈味氨基酸含量分別為中性蛋白酶（377 mg/100 g）＞堿性蛋白酶（2 9 8 m g/1 0 0 g）＞木瓜蛋白酶（256 mg/100 g）＞風(fēng)味蛋白酶（197 mg/100 g），占氨基酸總量的比例分別為29.29%、29.27%、27.53%和40.29%。由此可見，酶解液中均含有鮮甜味氨基酸，而風(fēng)味蛋白酶酶解液中鮮甜呈味氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。其他氨基酸如蛋氨酸，它作為含硫氨基酸雖然本身不會(huì)產(chǎn)生肉香，但對(duì)酶解液風(fēng)味的形成有重要的作用，其含量也在中性蛋白酶中最大，是熟肉香味的重要貢獻(xiàn)因素[32]。結(jié)果表明中性蛋白酶在甜味和鮮味兩項(xiàng)含量上高達(dá)377 mg/100 g，顯著高于其他3 種酶解液，且一些對(duì)呈味有幫助的氨基酸如蛋氨酸含量豐富，更利于改善產(chǎn)品風(fēng)味，賦予其更加圓潤(rùn)甘甜的口感。

2.2 感官評(píng)定結(jié)果

表5 鵝肉酶解液感官評(píng)分Table 5 Results of sensory evaluation for goose meat hydrolysates

由表5可知，4 種酶解液的共同特點(diǎn)是香味、濃厚感和鮮味評(píng)分普遍比較高，其中中性蛋白酶香味和鮮味的得分均為4 種酶解液中最高。蛋白酶在酶解過(guò)程中產(chǎn)生的疏水性氨基端會(huì)造成酶解液具有苦味，而苦味是酶解過(guò)程中應(yīng)盡量避免的。對(duì)于4 種酶解液，苦味評(píng)分順序?yàn)槟竟系鞍酌福緣A性蛋白酶＞中性蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶，分別為3.30、2.10、2.00、1.50 分，這可能是因?yàn)槟竟系鞍酌甘菐€基蛋白酶，易于釋放苦味氨基酸如賴氨酸、精氨酸以及苯丙氨酸，因此會(huì)加重酶解液的苦味[33]，但就鮮味和酸味而言，風(fēng)味蛋白酶的鮮味不夠且酸味明顯。綜上所述，感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明中性蛋白酶酶解液滋味特性優(yōu)于其他3 種酶解液，能更好地保留鵝肉的鮮味、濃厚感。

2.3 電子舌測(cè)定結(jié)果

利用電子舌自帶分析軟件對(duì)獲得的4 種酶解液及梯度溶液的信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，如圖1所示，PC1和PC2的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為93.90%，大于85%，這表明PC1和PC2中的信息量能夠反映測(cè)定樣品的大部分信息情況[34]。同時(shí)通過(guò)對(duì)傳感器信號(hào)值進(jìn)行處理區(qū)分指數(shù)達(dá)99.77，說(shuō)明電子舌能夠完全區(qū)分4 種蛋白酶酶解液在滋味方面存在顯著的差異。

圖1 不同蛋白酶酶解液電子舌PCA圖Fig. 1 Principal component analysis plot for the electronic tongue results of goose meat hydrolysates prepared with different enzymes

中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶3 種酶解液的數(shù)據(jù)點(diǎn)距離較近且相對(duì)集中，但距離參比溶液（0.1 mg/mL（MSG＋NaCl））最近的是中性蛋白酶酶解液，說(shuō)明中性蛋白酶酶解液的鮮咸味道更突出，而堿性蛋白酶酶解液與其他3 種酶解液和參比溶液都相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明它的滋味與其他溶液有顯著區(qū)別，這與感官評(píng)定的結(jié)果不完全一致，可能是酶解液本身味道復(fù)雜、電子舌滋味強(qiáng)度依據(jù)單一純物質(zhì)等多種原因造成的[3]。

3 結(jié) 論

采用感官結(jié)合電子舌的方法，并通過(guò)水解度、寡肽和氨基酸含量的差異分析不同蛋白酶酶解液。結(jié)果表明在45 ℃恒溫水浴酶6.5 h、加酶量1 200 U/g、固液比1∶3（g/mL）的條件下，木瓜蛋白酶酶解液的水解度和寡肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，分別為31.41%、0.22%，其次為中性蛋白酶。但中性蛋白酶制備的鵝肉蛋白酶解液得分最高，香味、鮮味最佳，味道濃郁且甜味和鮮味呈味氨基酸的含量顯著高于其他3 種酶，而木瓜蛋白酶酸味較重且鮮味比較弱，香氣不協(xié)調(diào)。因此，最終確定酶解鵝肉蛋白獲得呈味肽的最佳酶為中性蛋白酶。中性蛋白酶在鵝肉酶解過(guò)程中小分子肽及游離氨基酸含量不斷變化，它們相互作用，使得酶解液整體鮮味濃厚，并伴有酸味，其呈味肽濃郁，持香時(shí)間久，整體風(fēng)味良好。