郭夢(mèng)瑤，韓 燁*，李素燕

（天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津 300350）

果醋是以水果或果品加工的下腳料為主要原料，經(jīng)酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵釀制而成的一種集營(yíng)養(yǎng)食療為一體的新一代酸性調(diào)味品或飲料[1]。果醋的營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多種有機(jī)酸，人體所需的多種氨基酸、維生素及生物活性物質(zhì)，起到促進(jìn)血液循環(huán)、降血壓、調(diào)節(jié)體液酸堿平衡、抑制血糖升高、抗菌消炎和催眠鎮(zhèn)靜的作用[2-4]。

醋酸菌是能夠?qū)⒕凭趸癁榇姿岬囊活愇⑸锏目偡Q。醋酸菌對(duì)人及動(dòng)物均無致病性，且大部分醋酸菌性狀優(yōu)良，營(yíng)養(yǎng)要求較簡(jiǎn)單，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，可造成果實(shí)的細(xì)菌性腐敗，造成酒的酸化，產(chǎn)生氣味較溫和的有機(jī)酸，引起酒的變色與風(fēng)味改變[5-6]。優(yōu)良的醋酸菌菌種是影響果醋品質(zhì)的重要因素。國(guó)內(nèi)外果醋釀造專用醋酸菌大都為食醋菌種AS1.41（Acetobacter rancensvar.tubidans）和滬釀1.01（A.pasteurianussubsp.pasteurianus）等[7]。選育方法常用的有自然選育法或誘變育種法，但總體來看選育后的菌株產(chǎn)酸能力、耐酒精能力有限，而且發(fā)酵果醋形成的風(fēng)味也不佳[8]，轉(zhuǎn)酸率高的菌株可以充分利用原料資源，節(jié)約成本，因此急需選育綜合性能優(yōu)良，特別是轉(zhuǎn)酸率高的菌種。

冬棗也叫水果棗、冰糖棗，是目前棗中最高檔的鮮食品種。其營(yíng)養(yǎng)豐富，含19種人體必需氨基酸，維生素A、維生素E，鉀、鐵、銅、硒等多種微量元素；同時(shí)，棗多酚、黃酮含量高，具有較強(qiáng)的抗氧化活性、調(diào)節(jié)血脂和防治腦血管疾病的功效，是天然的滋補(bǔ)佳品[9-11]。我國(guó)有悠久的果醋制作歷史，冬棗醋作為一種冬棗深加工產(chǎn)品，既具有冬棗特有的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又兼有果醋的營(yíng)養(yǎng)成分和保健功能，是一種新型的天然營(yíng)養(yǎng)保健醋，具有廣闊前景[12]。柿子醋醅中含有多種優(yōu)良醋酸菌菌種，產(chǎn)酸迅速，其生產(chǎn)的柿子果醋富含多種香氣、口感濃醇、回味深長(zhǎng)，深受消費(fèi)者喜愛[13]。本研究從傳統(tǒng)自然發(fā)酵柿子醋醅中分離鑒定一株產(chǎn)酸性能優(yōu)異的菌株，并利用其進(jìn)行冬棗醋的發(fā)酵，通過單因素和正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，制得一款酸甜爽口的冬棗醋，為發(fā)掘利用醋酸菌資源，解決冬棗貯藏難的問題，開發(fā)營(yíng)養(yǎng)、美味和具有保健功能的新型冬棗醋提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料和菌種

柿子醋醅：山西運(yùn)城鹽湖區(qū)市場(chǎng)；奧爾蘭醋桿菌（Acetobacter orleanense）：國(guó)家菌種保藏中心CICC7001；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α：本實(shí)驗(yàn)室保藏；活性干酵母粉：中法王朝葡萄酒廠。

1.1.2 化學(xué)試劑

FlukaTM果膠酶（20 U/mg）：德國(guó)霍尼韋爾公司；pUCm-T載體、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）片斷凝膠回收試劑盒、TaqDNA聚合酶（5 U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、DNA片段回收純化試劑盒：上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量核酸DNA Marker：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

醋酸菌分離培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇3%，0.5%瓊脂，2%CaCO3，pH 4.5。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

Hoyer-Frateur培養(yǎng)基：乙醇3%，（NH4）2SO40.1%，KH2PO40.01%，MgSO4·7H2O 0.025%，F(xiàn)eCl30.000 5%。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

葡萄糖酸試驗(yàn)培養(yǎng)基：酵母膏3%，葡萄糖10%，K2HPO40.1%，MgSO40.035%，NaNO30.1%，KCl 0.025%，蛋白胨0.05%，瓊脂2%，CaCO32%。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI 2720聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)Thermo 公司；GIS-2009紫外凝膠成像儀：上海Tanon公司；HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DHP-420電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；A-103多功能榨汁攪拌機(jī)：浙江順敬工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柿子醋醅中高產(chǎn)酸醋酸菌的篩選

采用稀釋涂布平板法[14]對(duì)柿子醋醅中的醋酸菌進(jìn)行分離，稀釋至10-1、10-2和10-3濃度，將稀釋液涂布在醋酸菌分離培養(yǎng)基中，30 ℃、倒置培養(yǎng)3 d，鈣溶解圈直徑大的菌落相應(yīng)產(chǎn)酸性能優(yōu)良，從培養(yǎng)基中挑選菌落形態(tài)一致，透明圈直徑H與菌落直徑C的比值較大，具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的單個(gè)菌落，在平板上多次劃線分離、培養(yǎng)，對(duì)菌株進(jìn)行純化。將純化后的各菌株分別取一環(huán)接種于斜面分離培養(yǎng)基上，編號(hào)，并30 ℃條件下靜置培養(yǎng)3 d。按照文獻(xiàn)[15]中的FeCl3溶液法進(jìn)行產(chǎn)酸定性實(shí)驗(yàn)，篩選出產(chǎn)醋酸的單菌落菌株。

1.3.2 醋酸菌形態(tài)特征觀察

取一環(huán)篩選的菌株分別接種于分離培養(yǎng)基平皿上，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察菌落特征，并將各菌株進(jìn)行革蘭氏染色觀察其細(xì)胞形態(tài)，其運(yùn)動(dòng)性利用直針穿刺法進(jìn)行觀察。

1.3.3 醋酸菌的生理生化特征的測(cè)定

接觸酶、氧化酶、吲哚、V-P、明膠液化、乙醇過氧化、甘油生酮、產(chǎn)5-酮葡萄糖酸鹽參考文獻(xiàn)[16，17]進(jìn)行；以銨鹽為唯一氮源生長(zhǎng)試驗(yàn)：在Hoyer-Frateur培養(yǎng)基上接種斜面菌株并觀察生長(zhǎng)情況；產(chǎn)葡萄糖酸試驗(yàn)：取一環(huán)菌接種到葡萄糖酸試驗(yàn)培養(yǎng)基，觀察是否有透明圈。按照參考文獻(xiàn)[15]中的中和滴定法進(jìn)行菌株產(chǎn)醋酸能力的測(cè)定，取產(chǎn)酸能力最高的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照菌株為醋化醋桿菌奧爾蘭亞種（A.orleanense）。

1.3.4 醋酸菌的分子生物學(xué)鑒定

（1）16S rDNA基因片斷的擴(kuò)增

取分離得到醋酸菌菌株一接種環(huán)懸浮于50 μL ddH2O中混勻15 s，5 000 r/min離心1 min，取上清做模板。

上游引物：5'-GCT GGC GGC ATG CTT AAC ACA T-3'；

下游引物：5'-AACCACATGCTCCACCGCTTG-3'[18]。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50μL）：上下游引物各1μL（10pmol/μL），模板DNA（100 ng/μL）5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix 2 μL，超純水35 μL，Taq酶1 μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

（2）醋酸菌16S rDNA基因序列分析

按片斷凝膠回收試劑盒和DNA片段回收純化試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收及純化。按pUCm-T載體說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物與pUCm-T Vector連接，16 ℃條件下下反應(yīng)過夜。將連接產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果去除引物序列后在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，選取同源性高的模式菌株的16S rDNA序列，采用MEGA 5 軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 冬棗醋發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

冬棗選果、清洗→去核打漿→酶解→離心分離→澄清冬棗汁→成分調(diào)整→殺菌→冷卻→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→過濾→殺菌→冬棗醋

操作要點(diǎn)：

選果、清洗、去核打漿：選擇新鮮、成熟的果實(shí)，剔除爛果，用清水清洗2～3次。去除棗核，將冬棗用榨汁機(jī)破碎打漿。立即將果汁用真空抽濾機(jī)過濾，并在95 ℃下滅酶30 s。

果膠酶酶解：果膠酶用量0.08%，酶解溫度50 ℃，檸檬酸調(diào)pH 3.5，酶解時(shí)間3 h。

離心分離：在5 000 r/min的條件下離心10 min，除去沉淀得到澄清冬棗汁。

成分調(diào)整：添加蔗糖調(diào)節(jié)初始糖度為16%，檸檬酸調(diào)pH 4.5。

殺菌、冷卻：105 ℃條件下殺菌20 s，冷卻至50～55 ℃。

酵母菌活化：試管裝入0.5 g蔗糖于10 mL蒸餾水中，高壓滅菌后冷卻至37 ℃左右，加入0.5 g活性干酵母粉，37 ℃水浴活化30 min。將3接種環(huán)酵母菌活化液接入滅菌的5 mL冬棗汁中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)的酵母菌液按3%的接種量接入滅菌的100 mL冬棗汁，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，備用。

醋酸菌活化：將2接種環(huán)選定的產(chǎn)醋酸菌株接入滅菌的5 mL冬棗汁中于30 ℃、120 r/min搖床中培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)的菌株按3%的接種量接入滅菌的100 mL冬棗汁，于30 ℃、120 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，備用。

酒精發(fā)酵：初始糖度16%，酵母菌接種量5%，發(fā)酵溫度30 ℃，密閉靜置發(fā)酵至酒精度上升緩慢時(shí)停止。

醋酸發(fā)酵：調(diào)整初始酒精度為8%vol，醋酸菌接種量10%，裝液量為50 mL/150 mL，發(fā)酵溫度30 ℃，在50 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩發(fā)酵14 d，以發(fā)酵液酸度上升緩慢時(shí)發(fā)酵停止。

過濾、殺菌：用硅藻土抽濾，95 ℃殺菌10 min，冷卻后得到冬棗醋。

1.3.6 酒精發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

將冬棗汁的初始糖度分別調(diào)至8%、10%、12%、14%、16%、18%，分別接入0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%二級(jí)擴(kuò)培酵母液，將酒精發(fā)酵溫度分別調(diào)至10 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃，發(fā)酵時(shí)間為4 d，以考察不同酵母菌接種量、發(fā)酵溫度及初始糖度對(duì)冬棗汁酒精度的影響。

1.3.7 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

將冬棗汁的初始酒精度分別調(diào)至6%vol、8%vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol，分別接入6%、8%、10%、12%、14%、16%二級(jí)擴(kuò)培醋酸菌液，將發(fā)酵溫度分別調(diào)至26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃條件下發(fā)酵14 d，以考察不同醋酸菌接種量、初始酒精度及發(fā)酵溫度對(duì)冬棗醋酸度的影響。

1.3.8 冬棗醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)醋酸發(fā)酵溫度（A）、初始酒精度（B）、醋酸菌接種量（C），進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，以總酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，確定醋酸發(fā)酵的最佳工藝條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for acetic acid fermentation conditions optimization

1.3.9 冬棗醋品質(zhì)分析

（1）感官評(píng)價(jià)：根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 30884—2014《蘋果醋飲料》[19]，對(duì)冬棗醋色澤（20分）、香氣（20分）、滋味（40分）、外觀（20分）方面進(jìn)行感官評(píng)分，滿分100分，由10人品評(píng)取平均分，冬棗醋感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[20]見表2。

表2 冬棗醋感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of winter jujube vinegar

（2）理化指標(biāo)的測(cè)定：根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)冬棗醋中總酸含量（以醋酸計(jì)）進(jìn)行測(cè)定；采用重鉻酸鉀比色法測(cè)定酒精度；采用糖度計(jì)測(cè)定糖度；采用酸度計(jì)測(cè)定pH值。

（3）微生物指標(biāo)的測(cè)定：根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 7101—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲料》，對(duì)冬棗醋的菌落總數(shù)、大腸菌群及致病菌（指腸道致病菌）進(jìn)行檢驗(yàn)和測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌的分離鑒定

從醋酸菌分離純化固體培養(yǎng)基中挑選透明圈大，細(xì)胞形態(tài)類同，且占生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的單菌落80個(gè)，保留革蘭氏陰性產(chǎn)酸菌株12 株，按照A1～A12進(jìn)行編號(hào)。各菌株的菌落形態(tài)為白色半透明狀，圓形，隆起，表面光滑，直徑2～3 mm，均有運(yùn)動(dòng)性，在穿刺培養(yǎng)基中穿刺線向四周呈云霧狀擴(kuò)散。菌株A1革蘭氏染色呈陰性，細(xì)胞呈桿狀，大?。?.5～0.8）μm×（1.0～4.2）μm，成對(duì)或成鏈。

將篩選出的菌株A1～A12進(jìn)行生理生化試驗(yàn)鑒定，結(jié)果見表3。由表3可知，對(duì)照第九版《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，菌株A1、A2、A6、A8、A9不產(chǎn)2,5-二酮基葡萄糖酸、產(chǎn)5-酮基葡萄糖酸且不銨鹽為唯一氮源，初步判定為木醋桿菌（Acetobacter xylinum），菌株A3、A5、A10無甘油生酮表現(xiàn)且不產(chǎn)5-酮基葡萄糖酸，初步判定為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus），菌株A4、A11以銨鹽為唯一氮源，初步判定為醋化醋桿菌（Acetobacter aceti），菌株A7、A12產(chǎn)2,5-二酮基葡萄糖酸且無乙醇過氧化表現(xiàn)，初步判定為氧化葡糖桿菌（Gluconobacter oxydans）。

表3 分離醋酸菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of physiological and biochemical tests of isolated acetic acid bacteria

從不同種屬的菌株中選擇菌株A1、A3、A4、A7進(jìn)行產(chǎn)酸量試驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4可知，菌株A3產(chǎn)酸能力低于對(duì)照菌株，A7與對(duì)照菌株產(chǎn)酸能力相當(dāng)，均為9 d產(chǎn)酸量5.62 g/mL，菌株A1、A4的產(chǎn)酸能力高于對(duì)照菌株，A1產(chǎn)酸能力最高，為9 d產(chǎn)酸量5.89 g/mL。因此，選擇菌株A1進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

表4 分離醋酸菌的產(chǎn)酸量比較Table 4 Comparison of acid yield of isolated acetic acid bacteria

2.2 16S rDNA測(cè)序鑒定分離菌株的結(jié)果

2.2.1 16S rDNA基因片斷提取和PCR擴(kuò)增

選取醋酸產(chǎn)量高的菌株A1進(jìn)一步用分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。菌株A1 16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體后PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of recombinant plasmid by PCR

由圖1可知，觀察到出現(xiàn)0.8 kbp左右的一條純的DNA條帶，表明已獲得了純的菌株A1的16S rDNA基因片斷。

2.2.3 序列分析結(jié)果

將所測(cè)核苷酸序列用NCBI的基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）軟件進(jìn)行序列同源性分析。采用MegaX軟件的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。

圖2 基于16S rDNA序列菌株A1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain A1 based on 16S rDNA sequences

由圖2可知，在核酸水平上，菌株A1的16S rDNA部分序列與A.xylinum（登記號(hào)為X75619.1）的16S rDNA在同一分支且有98%的一致性。綜合細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)及生理生化特征、16S rDNA序列同源性比較，鑒定菌株A1為木醋桿菌（Acetobacter xylinum）。

2.3 冬棗醋發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 冬棗醋酒精發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

酒精作為醋酸發(fā)酵的重要原料，直接影響冬棗醋的酸度，進(jìn)而影響其品質(zhì)，使用酵母菌可以將糖代謝為酒精，以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察酒精發(fā)酵中酵母菌接種量、溫度和初始糖度對(duì)冬棗醋品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3a可知，酵母接種量在1%～5%范圍內(nèi)，酒精度隨接種量增加而增加；酵母接種量為5%時(shí)，酒精度最大，為8.2%vol；酵母接種量＞5%之后，酒精度基本穩(wěn)定不變。因此，最佳接種量為5%。

圖3 酵母菌接種量（a）、發(fā)酵溫度（b）和初始糖度（c）對(duì)冬棗醋酒精發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum (a),fermentation temperature (b) and initial sugar content (c) on alcoholic fermentation of winter jujube vinegar

細(xì)胞內(nèi)溫度升高，酶反應(yīng)加速，促進(jìn)代謝和生長(zhǎng)，但生物活性物質(zhì)可能發(fā)生變性使細(xì)胞功能下降。由圖3b可知，發(fā)酵溫度在24～30 ℃時(shí)，隨發(fā)酵溫度的升高，酒精度也隨之上升；發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，酒精度最大，為8.5%vol；發(fā)酵溫度＞30℃時(shí)，隨溫度的升高，酒精度反而下降。因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)溫度升高，酶反應(yīng)加速，促進(jìn)代謝和生長(zhǎng)，但生物活性物質(zhì)可能發(fā)生變性使細(xì)胞功能下降。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為30℃。

糖是酒精發(fā)酵的重要基質(zhì)原料，直接影響到酒精轉(zhuǎn)化情況，糖度高時(shí)產(chǎn)生的酒精度也相對(duì)較高，但過高反而抑制微生物的發(fā)酵。由圖3c可知。隨初始糖度在8%～16%范圍內(nèi)的增大，酒精度隨之增加；初始糖度為16%時(shí)，酒精度為8%vol；初始糖度＞16%之后，酒精度基本穩(wěn)定。因此，初步確定最適初始糖度為16%。

2.3.2 冬棗醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以酸度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察醋酸發(fā)酵中醋酸菌接種量、酒精度及發(fā)酵溫度對(duì)冬棗醋品質(zhì)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 醋酸菌接種量（a）、初始酒精度（b）及發(fā)酵溫度（c）對(duì)冬棗醋醋酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of acetic acid bacteria inoculum (a),initial alcohol content (b) and fermentation temperature (c) on acetic fermentation of winter jujube vinegar

由圖4a可知，酸度隨醋酸菌接種量在4%～10%范圍內(nèi)增加而升高，接種量在10%以上酸度變化不大，這是由于發(fā)酵液內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能高效利用。因此，選擇10%為醋酸菌最佳接種量。由圖4b可知，酸度隨初始酒精度在4%vol～8%vol范圍內(nèi)提高而升高，酒精度在8%vol以上酸度變化不明顯，選擇最適初始酒精度為8%vol。由圖4c可知，發(fā)酵溫度在26～30 ℃范圍內(nèi)增加，酸度隨發(fā)酵溫度升高而增加；發(fā)酵溫度在30 ℃時(shí)，酸度最大，為3.42 g/100 mL；發(fā)酵溫度＞30 ℃之后，酸度隨發(fā)酵溫度升高而降低。因此，選擇30 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.3.3 冬棗醋醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

為了確定冬棗醋醋酸發(fā)酵的最優(yōu)條件，對(duì)醋酸菌接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始酒精度（C）進(jìn)行3因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)，發(fā)酵時(shí)間為14 d，以酸度為考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)優(yōu)化醋酸發(fā)酵條件結(jié)果與分析見表5。

表5 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for acetic acid fermentation conditions optimization

續(xù)表

由表5可知，3個(gè)影響因素的主次關(guān)系是：A（發(fā)酵溫度）＞B（初始酒精度）＞C（接種量）。最佳發(fā)酵條件組合為A3B2C1，即冬棗醋醋酸發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度為32 ℃，初始酒精度為9%vol，接種量為8%，發(fā)酵時(shí)間為14 d。在此最佳醋酸發(fā)酵條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，冬棗醋總酸含量（以乙酸計(jì)）為4.76 g/100 mL。

2.4 冬棗醋醋飲料品質(zhì)評(píng)價(jià)

在最佳發(fā)酵條件下制備冬棗醋，成品冬棗醋的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表6。由表6可知，冬棗醋飲各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)均滿足相關(guān)國(guó)標(biāo)要求。

表6 冬棗醋品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination results of quality indexes of winter jujube vinegar

3 結(jié)論

本研究從民間傳統(tǒng)柿子醋醅中篩選出菌株A1，經(jīng)菌落細(xì)胞形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定其為木醋桿菌（Acetobacter xylinum）。將該木醋桿菌菌株用于冬棗醋發(fā)酵飲料的研制，采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化冬棗醋最佳醋酸發(fā)酵條件為木醋桿菌接種量8%，發(fā)酵溫度32 ℃，初始酒精度為9%vol。在此優(yōu)化醋酸發(fā)酵條件下釀造得到的冬棗醋感官評(píng)分91分，總酸含量（以醋酸計(jì)）4.76 g/100 mL，固形物含量1.5%，淡琥珀色，口味酸甜爽口，具有冬棗特有的果香，理化及微生物指標(biāo)均符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。