孫利林，李立郎，胡 萍 *，田 亞，麻穎垚，袁再順

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014）

醬香型白酒生產(chǎn)歷史悠久、源遠流長，一直深受人們的喜愛。其典型的代表是茅臺酒，酒體醬香突出、香味幽雅細膩、酒體醇厚、回味悠長、空杯留香[1-3]。醬香型白酒生產(chǎn)工藝獨特，具有高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、長期貯存的“四高一長”的工藝特點。一年一個生產(chǎn)周期，分二次投料，經(jīng)過八輪次發(fā)酵，七次蒸酒，長期陳釀，精心勾兌而形成其獨特的風味品質。醬香型白酒在其獨特的釀造環(huán)境和工藝條件下，酒曲、酒醅、窖泥中形成了豐富的微生物資源[4-7]。

醬香白酒釀造過程中可分離出的真菌，主要為酵母和霉菌[8-14]，酵母是產(chǎn)乙醇和重要風味物質的關鍵微生物，霉菌能夠分泌多種酶類，對釀造原料降解和中國白酒風味的形成有重要貢獻[15]。據(jù)報道，醬香型白酒發(fā)酵過程中的酵母菌群產(chǎn)酯豐富，對優(yōu)質醬香白酒風味的形成有重要的作用[10]。其主要作用是產(chǎn)酒產(chǎn)香，優(yōu)勢菌種有球擬酵母、假絲酵母、漢遜酵母等[16-17]。研究表明，大部分酵母具有產(chǎn)多元醇的能力，并且還可以代謝出苯乙醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙基苯酚、芳樟醇等物質[14]。霉菌的主要功能是分泌糖化酶、液化酶及蛋白酶，對分解釀酒原料中的淀粉、蛋白質等大分子物質具有積極的推動作用，使得整個反應體系中糖類及氨基酸含量升高，可為其他微生物的代謝提供基礎物質，亦為后續(xù)的酒體風味形成奠定基礎[18-19]。

本研究應用Illumina Miseq高通量測序技術，以醬香型白酒第四輪次酒釀造過程中高溫大曲、酒醅（堆積酒醅、窖內酒醅）以及窖泥為研究對象，針對不同酒廠以及同一酒廠新、老車間之間真菌多樣性進行對比研究，分析醬香型白酒釀造過程中真菌變化，探究釀造過程中的真菌群落結構以及各釀造階段的主要優(yōu)勢菌群動態(tài)變化規(guī)律，為優(yōu)化利用釀酒微生物資源和生產(chǎn)質量控制提供理論基礎支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒曲、酒醅（堆積酒醅、窖內酒醅）、窖泥樣品：采自貴州省仁懷市茅臺鎮(zhèn)H酒廠和J酒廠，采樣輪次為第四輪次。采樣方式為每層中心和四角收集，每100 g混合樣品裝于采樣袋，置于-80 ℃冰箱中備用。共采集17個樣品，具體樣品采集信息見表1。

表1 樣品采集信息情況Table 1 Information of collected sample

1.2 儀器與設備

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA提取及MiSeq測序分析

1.3.2 高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

測序得到的序列信息，首先根據(jù)雙端序列數(shù)據(jù)之間的對應關系，將成對的數(shù)據(jù)拼接成一條序列，同時對數(shù)據(jù)的質量和拼接的效果進行質控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的序列和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。之后利用不同軟件進行數(shù)據(jù)分析如：利用QIIME[21]等軟件在97%的相似性水平上利用UPARSE算法[22]進行分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）的聚類，并挑選出OUT的代表性序列，基于Silva和UNITE[23]數(shù)據(jù)庫對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學注釋分析、利用QIIME和R語言軟件對樣本進行Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析和群落變化分析等。

2 結果與分析

2.1 醬香型白酒釀造過程中的真菌多樣性分析

2.1.1 Rank-Abundance曲線

Rank-Abundance曲線可用來解釋多樣性的兩個方面，即物種豐度和物種均勻度。在水平方向，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大，說明其物種豐度最高；曲線的形狀（平滑程度）反映了樣品中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻。結合圖1曲線得出：大部分樣品的Rank-Abundance曲線在水平方向的跨度都在40以上，僅有小部分在20～40之間，說明醬香型白酒釀造過程中真菌的物種豐度較高，微生物群落結構復雜；另外，所有樣品的Rank-Abundance曲線形狀（傾斜率）整體比較陡，說明其中的真菌群落分布存在優(yōu)勢菌群。

圖1 Rank-Abundance曲線Fig.1 Rank-Abundance curve

2.1.2 真菌群落結構分析

基于門水平上的樣品群落結構柱狀圖，結果見圖2。

圖2 基于門水平的樣品菌落組成相對含量Fig.2 Relative abundance of microbial community based on phylum level

樣品菌落在基于門水平的組成情況見圖2。由圖2可知，在17個樣品中最主要的是子囊菌門（Ascomycota），其次是擔子菌門（Basidiomycota）、真菌界未定義菌類（Fungi_unclassified）、接合菌門（Zygomycota）。

圖3 基于屬水平的樣品菌落組成相對含量Fig.3 Relative abundance of microbial community based on genus level

樣品菌落在基于屬水平的組成情況見圖3。由圖3可知，在17個樣品中主要存在30個真菌菌屬，其中酒曲中主要是曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）嗜熱真菌屬（Thermomyces）、擬青霉屬（Paecilomyces）和紅曲霉屬（Monascus）等；堆積發(fā)酵中主要有擬青霉屬（Paecilomyces）、念珠菌屬（Candida）、紅曲霉屬（Monascus）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）等；窖內發(fā)酵中主要優(yōu)勢菌有嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、紅曲霉屬（Monascus）、踝節(jié)菌屬（Rasamsonia）和曲霉屬（Aspergillus）等；窖泥中主要優(yōu)勢菌有假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）、鐮刀菌屬/鐮孢屬（Fusarium）、短梗蠕孢屬（Trichocladium）和紅曲霉屬（Monascus）。

2.1.3 多樣本聚類樹

基于樣本OTU種類數(shù)計算樣本間的weighted unifrac距離，綜合考量序列數(shù)據(jù)、序列同源性、微生物構成的豐度等對各個樣本進行聚類，結果見圖4。由圖4可知，A0和A1之間距離較近，說明了同一酒廠的母曲A0與成品曲A1的真菌組成親緣關系較近。A1和C1之間距離較遠，說明不同酒廠大曲的真菌微生物親緣關系較遠，這可能與各酒廠之間制曲配方、工藝及地理環(huán)境有關。

圖4 樣本相似度分析樹狀圖Fig.4 Tree diagram of samples similarity analysis

A2和B2歸屬到了一起，但與C2相隔一定距離。結果表明，同一酒廠不論是新車間還是老車間，它們堆積發(fā)酵酒醅的真菌微生物菌相之間親緣關系很接近，而不同酒廠堆積發(fā)酵酒醅真菌微生物之間親緣關系較遠。不同酒廠雖然都在茅臺鎮(zhèn)赤水河邊，但酒廠間地理位置有一定距離，發(fā)酵車間環(huán)境微生物以及來自大曲的微生物親緣關系有較大差異。同時也說明了堆積發(fā)酵受空間環(huán)境的影響較大，發(fā)酵環(huán)境微生物的多樣性影響著堆積酒醅的微生物多樣性。A3、B3、C3都沒有同一歸屬，表明它們所含真菌種群結構差異較大，菌群之間的親緣關系較遠。這說明窖池不同，窖池微生態(tài)環(huán)境微生物的真菌組成存在很大差異，可能與窖池的結構、窖齡、環(huán)境條件都有關系，這也是值得下一步深入研究的問題。A4和C4沒有歸于同一歸屬并且與酒醅相距較遠，說明不同酒廠窖泥之間真菌菌相組成差別較大，這可能與窖泥的來源不同有關系。

同一酒廠新、老車間以及不同酒廠的窖內酒醅樣本進行聚類分析，結果見圖5。由圖5可知，A3-1和A3-2歸屬到了一起，B3-1和B3-2歸屬到了一起，但C3-1和C3-2之間距離相對較遠。說明H酒廠無論是新車間還是老車間同一窖池內發(fā)酵酒醅上面部分與下面部分的微生物親緣關系十分接近，但不同窖齡的窖內酒醅真菌群落有差異；而J酒廠的窖內酒醅上面部分與下面部分的微生物差異較大，J酒廠為新建酒廠，可能微生物群體還不太穩(wěn)定，也更進一步說明了窖齡是影響窖池真菌多樣性的關鍵因素。

圖5 窖內酒醅樣本相似度分析樹狀圖Fig.5 Tree diagram of similarity analysis of fermented grains in pit

窖內發(fā)酵中的微生物，長期在密封、高溫、高壓、高酸度、高酒精、高濕度的特殊環(huán)境下，微生物的遺傳性狀、功能特性、代謝機制等可能發(fā)生了改變，形成了獨特的較穩(wěn)定的窖池微生態(tài)菌群，也造成了不同窖池間微生物的親緣關系都較遠。微生物遺傳性狀、功能特性、代謝機制的改變，窖池微生態(tài)獨特菌群的形成，都是需要時間積累的。說明窖齡越老的窖池，其窖內發(fā)酵微生物特別是其優(yōu)勢菌群是值得深入挖掘研究的特殊微生物資源。

2.2 釀酒過程優(yōu)勢真菌群落動態(tài)變化分析

2.2.1 酒曲真菌多樣性分析

由圖6可知，H酒廠母曲和成品曲中的真菌組成差別不大，但成品曲真菌多樣性大于母曲。母曲中優(yōu)勢真菌更為突出，優(yōu)勢真菌為曲霉屬（Aspergillus）（64.43%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（27.79%）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）（3.85%），其次是擬青霉（Paecilomyces）（3.63%）以及其他真菌。這與高溫制曲的工藝密切相關。以米曲霉為主的霉菌具有很強的產(chǎn)葡萄糖氧化酶、糖化酶和蛋白酶等酶活性能；嗜熱子囊菌屬有產(chǎn)木聚糖酶、堿性耐熱過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、角質酶等酶類，它們在后續(xù)的堆積糖化發(fā)酵以及對醬香風味的形成起著重要的作用。成品曲中優(yōu)勢菌群與母曲相比增加了多樣性，而嗜熱真菌屬的菌群數(shù)量顯著增多，曲霉菌屬和青霉屬的菌群相對減少。其中，曲霉屬（Aspergillus）（55.00%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（28.11%）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）（11.7%）是H酒廠成品曲中重要的微生物菌群，其次還有擬青霉屬（Paecilomyces）（1.44%）、踝節(jié)菌屬（Rasamsonia）（1.17%）、子囊菌綱未鑒別菌屬（Ascomycota_unidentified）（1.14%）、紅曲霉屬（Monascus）（1.11%）、毛孢子菌屬/絲孢酵母屬（Trichosporon）（0.04%）等。J酒廠成品曲C1中的主要真菌是嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（49.85%）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）（19.24%），踝節(jié)菌屬（Rasamsonia）（14.90%）、曲霉屬（Aspergillus）（7.58%）、紅曲霉屬（Monascus）（4.89%）等。A1與C1相比主要優(yōu)勢菌群的豐度存在明顯差異，說明醬香型白酒生產(chǎn)酒曲中主要發(fā)酵微生物菌相是相似的，但組成比例有差異。主要原因可能是不同酒廠間制曲工藝相似，但具體的工藝參數(shù)及釀酒環(huán)境有所不同，這也是同一地區(qū)不同品牌白酒質量和風味有所差異的原因之一。

圖6 不同車間不同酒廠酒曲樣品真菌群落結構餅狀圖Fig.6 Pie chart of fungal community structure of different Jiuqu samples in different workshops of different distilleries

2.2.2 堆積酒醅真菌多樣性分析

堆積發(fā)酵是將淀粉轉化成糖的關鍵環(huán)節(jié)，這時需要更多的微生物代謝產(chǎn)生大量的水解酶類。由于堆積發(fā)酵環(huán)境的高溫特殊性，耐熱微生物的優(yōu)勢就凸顯出來，成為了優(yōu)勢菌群。堆積發(fā)酵是開放的發(fā)酵環(huán)節(jié)，除了拌入大曲中的微生物以外，還網(wǎng)羅環(huán)境中的微生物，對醬香型風味的形成影響也很大。由圖7可知，擬青霉屬（Paecilomyces）是H酒廠堆積酒醅中的主要優(yōu)勢菌群，在A2和B2中相對豐度分別達到75.08%和67.71%。另外，A2中的主要優(yōu)勢菌群還有：嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（8.25%）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）（7.05%）、曲霉屬（Aspergillus）（4.47%）、紅曲霉屬（Monascus）（3.53%）；B2中紅曲霉屬（Monascus）也是主要優(yōu)勢菌群，豐度達（25.42%）。與A2相比，B2中的嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（2.85%）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）（2.09%）、曲霉屬（Aspergillus）（1.06%）的豐度降低，優(yōu)勢菌群更加突顯，擬青霉屬和紅曲霉屬，特別是紅曲霉屬數(shù)量增加顯著。紅曲霉產(chǎn)β-淀粉酶及產(chǎn)蛋白酶活性較強，在釀酒、制醋和腐乳中，對乙醇發(fā)酵和風味的產(chǎn)生都發(fā)揮著重要的作用，值得進一步研究。老車間已使用30多年，發(fā)酵車間使用年限越長，微生物的多樣性降低，但微生物優(yōu)勢菌群越突出，可能更有利于釀酒發(fā)酵及風味的產(chǎn)生。

圖7 不同車間不同酒廠堆積酒醅真菌群落結構餅狀圖Fig.7 Pie chart of fungal community structure of accumulated fermented grains in different workshops of different distilleries

J酒廠的堆積酒醅C2中假絲酵母屬/念珠菌屬（Candida）（44.48%）是最優(yōu)勢的，另外嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（17.83%）、曲霉屬（Aspergillus）（14.13%）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）（10.79%）、紅曲霉屬（Monascus）（2.47%），也是重要的微生物菌群。A2與C2相比主要優(yōu)勢菌群存在明顯差異，雖然所用酒曲菌相似，但豐度和占比差異較大。這說明不同的酒廠發(fā)酵車間之間環(huán)境微生物多樣性的差異影響著堆積酒醅的微生物多樣性。另外，不同酒廠的發(fā)酵工藝雖然相似，但工藝差數(shù)的不一樣也可能造成優(yōu)勢菌群差異，這也是不同酒廠的酒品質和風味差異化的主要原因之一。

2.2.3 窖內酒醅真菌多樣性分析

由圖8可知，3種窖內釀酒真菌菌群多樣性均較高，但種群結構差異較大。A3中主要微生物為曲霉屬（Aspergillus）（52.89%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（19.49%），紅曲霉屬（Monascus）（5.44%）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）（5.19%）、踝節(jié)菌屬（Rasamsonia）（2.74%）、子囊菌綱未鑒別菌屬（Ascomycota_unidentified）（2.63%）、假絲酵母屬/念珠菌屬（Candida）（2.57%）及其它未歸類的真菌菌群。B3中則仍然以擬青霉屬（Paecilomyces）（35.45%）占比最大、此外還有嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（17.94%）、紅曲霉屬（Monascus）（18.45%）為主要微生物菌群，另外嗜熱真菌屬（Thermomyces）（9.83%）、曲霉屬（Aspergillus）（8.42%）、踝節(jié)菌屬（Rasamsonia）（2.38%）、假絲酵母屬/念珠菌屬（Candida）（1.67%）等也是重要的微生物菌群。A3與B3相比主要優(yōu)勢菌群差異較大，說明同樣的制酒工藝，同樣的酒曲，不同使用年齡的車間和窖池，窖內發(fā)酵酒醅真菌多樣性的差異較大。老窖池中真菌菌落多樣性同樣較高，并且主要優(yōu)勢真菌的種類和豐度與堆積發(fā)酵酒醅相關度高。這說明使用時間長的車間和窖池其環(huán)境微生物種群結構更穩(wěn)定，優(yōu)勢菌群更突出。J酒廠窖內酒醅C3中曲霉屬（Aspergillus）（22.39%），嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（19.81%）是主要突出的優(yōu)勢菌群，這與A3主要優(yōu)勢菌群相似，但豐度有差異；其次假絲酵母屬/念珠菌屬（Candida）（9.32%）、嗜熱真菌（Thermomyces）（6.57%）、絲孢酵母屬（Trichosporon）（5.66%）、紅曲霉屬（Monascus）（4.87%）、青霉屬（Paecilomyces）（3.57%）、踝節(jié)菌屬（Rasamsonia）（3.57%）也是重要的微生物菌群，J酒廠的車間使用年限及窖齡也不長，說明窖內發(fā)酵與發(fā)酵車間使用年限和窖齡密切相關。

由以上分析可知：窖內發(fā)酵是醬香型白酒真菌種群最豐富的環(huán)節(jié)，這一環(huán)節(jié)的真菌微生物多樣性最高。由于窖內發(fā)酵是在密封、高溫、高壓等極端環(huán)境條件下，不同酒廠窖內酒醅真菌種類差異不大，主要優(yōu)勢菌群都是曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱子囊菌（Thermoascus）、假絲酵母屬/念珠菌屬（Candida）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、青霉屬（Paecilomyces）和紅曲霉屬（Monascus），但豐度差異是明顯的。曲霉是釀酒、制醋粬的主要菌種?，F(xiàn)代工業(yè)利用曲霉生產(chǎn)各種酶制劑（淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等）、有機酸（檸檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等），農(nóng)業(yè)上用作糖化飼料菌種。早在二千多年前，我國人民已懂得依靠曲霉來制醬，我國特有的調制品豆豉，也是利用曲霉分解豆類而作。由此可看出，窖內發(fā)酵中曲霉成為主要的優(yōu)勢菌與醬香風味的產(chǎn)生相關性很大，值得進一步深入研究。

圖8 不同車間不同酒廠窖內酒醅真菌群落結構餅狀圖Fig.8 Pie chart of fungal community structure of fermented grains in pits in different wineries in different workshops

2.2.4 窖泥真菌多樣性分析

窖泥的主要作用是密封窖內發(fā)酵，為窖內發(fā)酵提供一個密閉環(huán)境，同時也是和窖內酒醅接觸最緊密的物質。由圖9可知，不同酒廠使用的窖泥中真菌組成差異明顯。A4中的主要真菌是假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）（39.97%）和真菌界未定義菌類（Fungi_unclassified）（34.14%），其次為紅曲霉屬（Monascus）（12.17%）等。C4中真菌多樣性較高，主要微生物除了未鑒定菌屬（unclassified）占多數(shù)外，鐮刀菌屬/鐮孢屬（Fusarium）（18.09%）和短梗蠕孢屬（Trichocladium）（9.32%）、被孢霉屬（Mortierella）（6.8%），與A4對比主要優(yōu)勢菌群存在明顯差異。這可能是不同酒廠的窖泥來源和使用時間、使用方法不一樣造成的。

圖9 不同酒廠窖泥真菌群落結構餅狀圖Fig.9 Pie chart of fungal community structure in pit mud from different distilleries

3 結論

采用微生物高通量測序分析技術，對醬香型白酒第四輪次酒曲、堆積酒醅、窖內酒醅和窖泥進行真菌微生物多樣性和優(yōu)勢種群結構變化進行分析，結果表明：醬香型白酒的高溫大曲、堆積發(fā)酵和窖池發(fā)酵的真菌資源豐富且主要優(yōu)勢菌群存在動態(tài)變化：在酒曲中主要優(yōu)勢菌有曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）；堆積發(fā)酵中主要優(yōu)勢菌有擬青霉屬（Paecilomyces）、假絲酵母屬/念珠菌屬（Candida）和紅曲霉屬（Monascus）；窖內發(fā)酵中主要優(yōu)勢菌有嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）和紅曲霉屬（Monascus）；窖泥中主要優(yōu)勢菌有假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）、鐮刀菌屬/鐮孢屬（Fusarium）和短梗蠕孢屬（Trichocladium）。同一酒廠新老車間酒曲、堆積發(fā)酵、窖內發(fā)酵、窖泥之間真菌組成相似度較高，不同酒廠酒曲、堆積發(fā)酵、窖內發(fā)酵、窖泥之間真菌組成相似度亦較高，但其優(yōu)勢菌群豐度差異顯著。發(fā)酵車間使用年限及窖齡影響著微生物多樣性；時間長的車間和窖池車間和窖池其環(huán)境微生物種群結構更穩(wěn)定，優(yōu)勢菌群更突出。