劉夢雅，蘇加坤，王若琪，徐 達，秦秀軍，李建國，安 全，蔡繼寶，*

(1.中國輻射防護研究院，藥物毒理與放射損傷藥物山西省重點實驗室，中核放射毒理與放射性藥物臨床前評價重點實驗室，山西 太原030006；2.江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，江西 南昌 330096)

據(jù)2019年發(fā)布的《中國心血管病報告2018》顯示，我國心血管病現(xiàn)患人數(shù)為2.9億，心血管病死亡率居首位[1]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)分析以及許多試驗研究結(jié)果表明，吸煙除直接危害到人體的呼吸系統(tǒng)外，對人體的心腦血管、消化道等組織器官均產(chǎn)生不同程度的損害[2]。而多項研究表明煙草中含有引起冠狀動脈硬化、高血壓、冠心病等心血管疾病的發(fā)病率升高的成分[3-5]。本草香是香藥本草制備的各種香料，其在疾病預(yù)防與治療方面的功用也受到人們的關(guān)注[6]，本研究采用添加本草香成分香煙與普通香煙干預(yù)大鼠后，利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記(tandem mass tags，TMT)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)探索本草香對大鼠心血管系統(tǒng)相關(guān)蛋白的改變情況，旨在尋找差異蛋白以及相關(guān)生物學(xué)通路，為進一步研究本草香的生物學(xué)功效提供研究線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量200～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK-(京)2016-0006，質(zhì)量合格證號11400700300671。飼養(yǎng)管理于中國輻射防護研究院動物實驗中心，實驗動物使用許可證號SYXK(晉)2013-0002。

1.2 試劑和主要儀器

普通卷煙和添加本草香成分的金圣4號卷煙，均產(chǎn)自江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，每支卷煙含煙堿1.0 mg，焦油10.0 mg，一氧化碳10.0 mg；HRH-WBE 3986型動物全身煙氣暴露系統(tǒng)，購于北京慧榮和科技有限公司；TMT標(biāo)記試劑盒，購于Thermo Fisher公司。

1.3 動物分組及處理

根據(jù)動物體質(zhì)量按分段均衡隨機分組法(DAS1.0軟件)將動物進行分組，分為普通香煙煙氣暴露組和金圣4號香煙煙氣暴露組，每組12只。兩組分別放置于染毒腔體內(nèi)進行主流煙氣暴露染毒60 min，煙氣濃度控制在(1 100±110)mg/m3。每天染毒1次，3個月后麻醉取心臟，送樣本檢測。

1.4 蛋白提取及TNT定量蛋白質(zhì)組學(xué)實驗操作步驟

將冷凍的樣品心臟組織取出適量，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。加入300 μL樣品裂解液，加入蛋白酶抑制劑PMSF使其終濃度為1 mmol/L。冰上超聲破碎3 min。將溶液在室溫下12 000 r/min離心10 min，取上清，并再次離心取上清。上清即為樣品的總蛋白溶液，進行蛋白濃度測定并分裝后儲存于-80℃?zhèn)溆?。蛋白采用BCA法測定蛋白濃度。每個樣品取10 μg蛋白，采用12%SDS-PAGE進行分離；分離后的凝膠采用考馬斯亮蘭染色法進行染色。胰蛋白酶酶解及標(biāo)記：蛋白定量后每個樣品各取100 μg于10 K的超濾管中，取120 μL還原劑緩沖液(10 mmol/L DTT，8 mol/L尿素，100 mmol/L TEAB，pH=8.0)，60℃反應(yīng)1 h；加入IAA至終濃度為50 mmol/L，室溫避光反應(yīng)40 min；4℃、12 000 r/min離心20 min，棄掉收集管底部溶液；加入300 mmol/L的TEAB緩沖液100 μL，12 000 r/min離心20 min，2次；更換新收集管，在超濾管中加入300 mmol/L的TEAB緩沖液100 μL，并加入1 μg/μL的測序級胰蛋白酶溶液2 μL，37℃反應(yīng)12 h；12 000 r/min離心20 min，收集酶解后肽段，在超濾管中再加入200 mmol/L的TEAB緩沖液50 μL，12 000 r/min離心20 min，收集管底溶液并凍干。向凍干樣品中加入200 mmol/L的TEAB緩沖液100 μL，渦流混勻，取出40 μL樣品于1.5 mL EP管中進行標(biāo)記反應(yīng)；從冰箱中取出TMT試劑，平衡到室溫，加入41 μL無水乙腈，渦流5 min，離心；取41 μL TMT試劑加到樣品中，渦流混勻，室溫放置1 h；加入8 μL 5%羥胺終止反應(yīng)15 min，凍干后于-80℃保存。反相色譜分離：梯度洗脫收集8～60 min的樣品，依次每隔1 min收集洗脫液到1～15號離心管中，按此順序循環(huán)收樣至梯度結(jié)束。收集好后真空冷凍干燥抽干，樣品冷凍保存進行質(zhì)譜檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Proteome DiscovererTM2.2(美國Thermo公司)軟件分析差異蛋白，所用數(shù)據(jù)庫為來自于UniProt的大鼠數(shù)據(jù)庫。肽段鑒定的假陽性率控制在1%以下，利用倍數(shù)變化值進行差異蛋白篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥1.2且P≤0.05。采用基因本體(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Gene and Genomic Encyclopedia，KEGG)數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行富集分析，以判定差異蛋白主要影響的生物學(xué)功能或者通路。對差異蛋白進行非監(jiān)督層次聚類，利用熱圖的形式展示差異基因在不同樣本間的表達模式。

2 結(jié)果

2.1 普通香煙組與金圣4號香煙組大鼠心臟組織差異表達蛋白

用TMT法檢測吸煙3個月后普通香煙組與金圣4號香煙組大鼠心臟組織蛋白的表達情況，在兩組組織中，表達水平差異在1.2倍以上的蛋白43個，其中在金圣4號香煙組心臟組織中下調(diào)表達41個，上調(diào)表達2個。圖1將比較產(chǎn)生的差異表達情況反映到火山圖中，圖2為聚類分析結(jié)果，即對差異表達蛋白進行的非監(jiān)督層次聚類，如同一樣品能通過聚類出現(xiàn)在同一簇中，則聚在同一簇中的蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能。

圖1 普通香煙組與金圣4號香煙組大鼠心臟組織差異表達蛋白火山圖

圖2 普通香煙組與金圣4號香煙組大鼠心臟組織差異蛋白熱圖

2.2 普通香煙組與金圣4號香煙組大鼠心臟組織差異蛋白的GO富集分析

根據(jù)GO分析對基因的注釋，對普通香煙組與金圣4號香煙組大鼠43個差異表達蛋白進行分子功能、細(xì)胞組分及生物學(xué)過程的分類，分析結(jié)果顯示分子功能富集主要涉及結(jié)構(gòu)分子活動、NADPH綁定和細(xì)胞黏附分子結(jié)合等；細(xì)胞組分富集主要涉及細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域部分和細(xì)胞外區(qū)域等；生物過程富集主要涉及細(xì)胞激活、調(diào)節(jié)體液水平和血小板活化等。詳見圖3～5。

圖3 分子功能富集分析結(jié)果

圖4 細(xì)胞組分富集分析結(jié)果

圖5 生物過程富集分析結(jié)果

2.3 差異蛋白的KEGG富集分析

對普通卷煙和金圣4號香煙煙氣暴露3個月組大鼠心臟組織差異蛋白進行KEGG富集分析，得到蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的代謝途徑以及這些蛋白質(zhì)的功能差異，差異蛋白涉及血小板活化、補體和凝血級聯(lián)、氮代謝、半乳糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、果糖和甘露糖代謝等6個生物學(xué)通路。見表4和圖6。

表4 煙氣染毒干預(yù)3個月后兩組大鼠心臟組織差異蛋白的生物學(xué)通路

圖6 煙氣染毒3個月后兩組大鼠心臟組織差異蛋白的生物學(xué)通路

2.4 蛋白相互作用分析

基于OmicsBean組學(xué)數(shù)據(jù)整合分析云平臺，進行了差異蛋白及KEGG通路之間的蛋白互作分析，分析得到蛋白互作匯總結(jié)果。KEGG富集結(jié)果中顯著性前十的通路以及與之互作的蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖7。

3 討論

在我國，心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率居高不下，占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上。研究表明，吸煙可引起心血管系統(tǒng)的損傷，增加心血管發(fā)病的風(fēng)險[1]。研究顯示，損傷作用機制可能與吸煙對血液中的血小板黏性的改變有關(guān)，血小板黏性增加可導(dǎo)致冠脈血栓的形成，從而增加心肌梗死的發(fā)病率，此外，血小板在冠心病中冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂及血栓形成導(dǎo)致猝死中起重要作用[7]。

圖7 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

本草香是中國醫(yī)藥史中一類具有多種功效的香藥，見載于《本草綱目》等重要本草典籍，研究表明，本草香藥除能產(chǎn)生良好的香味刺激外，還能促進機體免疫球蛋白含量提高，進而增強人體防御疾病的能力[6]，本文旨在研究本草香的生物學(xué)功效。通過采用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對吸煙組43個差異蛋白進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，在吸煙后3個月蛋白表達的改變涉及到多種分子功能、細(xì)胞組分及生物學(xué)過程的變化，主要包括結(jié)構(gòu)分子活動、血小板活化、血液凝固、細(xì)胞外空間等。

我們篩選出與脂蛋白的轉(zhuǎn)化與代謝過程有關(guān)的載脂蛋白E(ApoE)，ApoE是一種多態(tài)性蛋白，其濃度與血漿甘油三酯含量呈正相關(guān)。研究表明，ApoE基因多態(tài)性與血脂異常以及冠狀動脈粥樣硬化的關(guān)系密切，其中ApoE4型是冠心病發(fā)生的重要影響因子[8]。差異表達基因的KEGG富集分析的結(jié)果顯示，差異表達蛋白涉及6個生物學(xué)通路，主要有血小板活化、補體和凝血級聯(lián)及代謝功能等。血小板活化是動脈粥樣硬化血栓的標(biāo)志特征之一，血小板活化后會發(fā)生血小板聚集率增加，氧自由基，血栓素以及血小板活化因子合成明顯增加，同時在冠心病的發(fā)病中也起著重要作用[9]。凝血與補體級聯(lián)反應(yīng)信號通路中有多種與疾病相關(guān)的炎癥或免疫類差異蛋白，這些蛋白各自執(zhí)行生理功能，且又相互聯(lián)系[10]，該信號通路上的差異蛋白點可以作為本草香發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點。除此之外，差異表達蛋白還涉及氮代謝以及糖代謝途徑。

本研究主要觀察了兩種香煙干預(yù)3個月后大鼠心臟組織蛋白表達的變化，篩選出差異蛋白，這些蛋白多數(shù)與血小板活化、補體和凝血級聯(lián)和代謝等生物學(xué)途徑相關(guān)。表明本草香干預(yù)對心血管系統(tǒng)的影響涉及多個蛋白及生物學(xué)過程，是一個復(fù)雜且相互影響的過程，此次篩選出的相關(guān)結(jié)果將為進一步研究普通香煙組大鼠與金圣4號香煙組造成的差異表蛋白以及作用機制提供研究線索，為研究本草香的生物學(xué)功效提供研究幫助。