馬曉骉，張 麒，潘定國

(云南省腫瘤醫(yī)院生物治療中心，云南 昆明 650118)

程序性死亡因子1配體B7同系物1(B7 homology 1，B7-H1)，又稱CD274，是共刺激分子B7超家族中最重要的成員之一，可通過負向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)抑制T細胞活化和增殖，促進癌細胞的免疫逃逸。人類多種腫瘤類型，包括結(jié)直腸癌中B7-H1呈高表達，是患者預后不良的指標之一[1-4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是內(nèi)源性的長度約為18～24個核苷酸的非編碼RNA，通過與靶基因 3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslational region，3′-UTR)互補結(jié)合，發(fā)揮mRNA降解或蛋白抑制作用。miRNA靶位點的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)可影響基因表達，進而影響腫瘤的易感性[5-6]。前期有研究顯示位于B7-H1基因3′-UTR區(qū)的rs4143815位點的等位基因突變破壞了miR-570介導的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，增加了胃癌的發(fā)病風險[7-8]。本研究探討B(tài)7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性與中國人群結(jié)直腸癌發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)，并分析其與B7-H1 mRNA表達的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

病例組來源于云南省腫瘤醫(yī)院2012年3月至2017年5月入院無親緣關(guān)系的215例結(jié)直腸癌患者，均為漢族，取EDTA抗凝外周靜脈血標本。入選標準：①病理學確診為結(jié)直腸癌患者；②未經(jīng)放化療治療。排除標準：①結(jié)直腸癌手術(shù)復發(fā)者；②結(jié)直腸轉(zhuǎn)移癌而非原發(fā)性腫瘤者。對照組外周靜脈血標本236例選自同期到醫(yī)院進行體檢的健康人群。排除有腫瘤病史、腫瘤家族史和非漢族個體。其中，病例組男性125例，女性90例，平均年齡(59.0±12.3)歲。臨床I-II和III-IV期患者各108和107例，高分化和中低分化癌各158和57例，有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各77和138例。對照組男性148例，女性88例，平均年齡(58.4±9.7)歲。性別和年齡在病例和對照組中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

另外，收集手術(shù)切除結(jié)直腸癌和癌旁正常組織樣本(距癌組織5 cm以上的遠端組織)65例，液氮速凍，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和儀器

血液和組織DNA提取試劑盒、Trizol試劑、TIANScriptⅡ RT Kit、FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)均購自北京天根生化科技有限公司；PCR儀和定量PCR儀均為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3 DNA提取及序列測定

采用血液基因組DNA提取試劑盒(提取全血基因組DNA，分光光度法測定DNA濃度和純度。運用直接測序法對B7-H1基因rs4143815位點進行分型。參考文獻[9]合成引物，引物序列如下：5′-GATACACATTT GGAGGAGACG-3′(上游)，5′-CAAATACTCCATGTTT TACTAG-3′(下游)。PCR反應(yīng)體系 50 μL，包含2 ×PCR buffer 25 μL、上游引物 2 μL、下游引物 2 μL、模板DNA 2.5 μL和去離子水18.5 μL?；靹?，置于PCR儀中，設(shè)置如下反應(yīng)條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物送擎科生物科技有限公司測序。

另外，采用組織DNA提取試劑盒提取65例結(jié)直腸癌和癌旁正常組織樣本DNA，采用上述方法對B7-H1基因rs4143815位點進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物送擎科生物科技有限公司測序。

1.4 定量PCR

Trizol試劑提取65例結(jié)直腸癌和癌旁組織總RNA，分光光度法測定RNA濃度和純度。TIANScriptⅡ RT Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，F(xiàn)astFire qPCR PreMix(SYBR Green)進行擴增。B7-H1定量PCR擴增引物：5′-GGTGGTGCCGACTACAA-3′(上游)，5′-TAGCCCT CAGCCTGACAT-3’(下游)。以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參照，引物序列如下：5′-ATGGGGA AGGTGAAGGTCG-3′(上游)，5′-GGGGTCATTGATGG CAACAATA-3′(下游)。按照 FastFire qPCR PreMix試劑盒說明配制反應(yīng)體系，混勻，置于定量PCR儀，設(shè)置如下反應(yīng)條件：94℃、5 min，94℃、30 s，60 ℃、35 s，40個循環(huán)。采用 2-ΔΔCT法計算結(jié)直腸癌中B7-H1 mRNA的相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。采用擬合優(yōu)度卡方檢驗分析B7-H1基因rs4143815位點在病例組和對照組中的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。運用logistic回歸計算比值比(odds ratio，OR)和95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)，OR經(jīng)性別和年齡調(diào)整。秩和檢驗分析B7-H1 mRNA在不同組別中表達變化。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

病例組和對照組中均檢測到B7-H1基因rs4143815位點3種基因型，分別為CC、CG和GG基因型，3種基因型在對照組中的頻率分別為37.7%、44.1%和18.2%，在病例組中的頻率分別為27.9%、44.2%和27.9%。經(jīng)檢驗，均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，P值分別為 0.32和0.20。

2.2 B7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌風險的相關(guān)性

運用測序法檢測結(jié)直腸癌組和對照組外周靜脈血中B7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性，并分析其與結(jié)直腸癌風險的相關(guān)性，見表1。與對照組相比，GG和CG/GG基因型顯著增加了結(jié)直腸癌的發(fā)病風險[GG與CC相比：OR調(diào)整=1.99，95%CI(1.19，3.34)，P=0.008；CG/GG與CC相比：OR調(diào)整=1.58，95%CI(1.06，2.36)，P=0.02]。C和G等位基因在對照組中的頻率分別為59.7%和40.3%，在病例組中的頻率均為50.0%。與對照組相比，G等位基因顯著增加了結(jié)直腸癌的發(fā)病風險[OR調(diào)整=1.48，95%CI(1.14，1.93)，P=0.004]。分層分析顯示，B7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無明顯相關(guān)。

表1 B7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌的相關(guān)性

2.3 B7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌中B7-H1 mRNA表達的相關(guān)性

定量PCR檢測B7-H1 mRNA在65例結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達，如圖1A所示，B7-H1 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織(P=0.02)。B7-H1 mRNA在不同腫瘤臨床分期(I-II期和III-IV期)、分化程度(高中分化與中低分化)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)(有和無)等生物學行為中的差異無統(tǒng)計學意義(圖1B～D)。進一步對比B7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌中B7-H1mRNA表達的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)65例結(jié)直腸癌組織中，B7-H1基因rs4143815位點CC基因型18例，CG基因型29例，GG基因型18例。B7-H1基因rs4143815位點GG基因型患者B7-H1 mRNA水平明顯高于B7-H1基因rs4143815位點CC基因型患者(P=0.03)，見圖1E。

圖1 B7-H1 mRNA相對表達量

3 討論

B7-H1作為重要的免疫治療靶點，在腫瘤的治療過程中已經(jīng)取得了一定效果。作為負性調(diào)控分子，B7-H1在生理狀況下表達較低，腫瘤細胞中表達明顯增加[1-4]。既可與其受體PD1結(jié)合抑制B細胞活化，又可與非PD1受體結(jié)合誘導細胞毒性T淋巴細胞凋亡，參與腫瘤細胞的免疫逃逸。B7-H1表達一致的不同個體罹患腫瘤的風險不盡相同，提示遺傳變異可能影響不同個體對腫瘤的易感性不同。以往多項研究均證實該觀點[10-11]。

最近，國內(nèi)外研究表明B7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性與多種腫瘤的發(fā)病有關(guān)。Wang等[8，12]研究小組發(fā)現(xiàn)B7-H1基因rs4143815位點GG基因型增加了胃癌的發(fā)病風險。Xie等[13]報道B7-H1基因rs4143815位點GG基因型攜帶者血清中B7-H1表達明顯升高，罹患肝癌的風險明顯增加[OR調(diào)整=1.62，95%置信區(qū)間(1.26，2.06)]，預示著更差的預后。相反，程仕光等[9]發(fā)現(xiàn)攜帶B7-H1基因rs4143815位點GG基因型肝癌患者總體生存時間延長。Tan等[14]報道B7-H1基因rs4143815位點GG基因型顯著增加了卵巢癌的發(fā)病風險[OR=2.34，95%置信區(qū)間(1.27，～4.30)]，但是對應(yīng)的B7-H1 mRNA表達量卻顯著降低。雖然B7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性與肺腺癌、鱗狀細胞癌和非小細胞肺癌發(fā)病和預后無關(guān)[15-16]。但是，攜帶B7-H1基因rs4143815位點CC和CG基因型的晚期非小細胞肺癌患者對尼魯單抗更敏感，經(jīng)過治療后具有更好的客觀緩解率和無進展生存期[17]。然而，Zhou等[18]報道B7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性與食管鱗狀細胞癌的發(fā)病風險和預后無關(guān)。與以上陽性結(jié)果相同，本研究發(fā)現(xiàn)B7-H1基因rs4143815位點GG基因型和G等位基因攜帶者結(jié)直腸癌的發(fā)病風險分別增加了1.99和1.48倍，提示可能是結(jié)直腸癌的易感基因之一。全基因組關(guān)聯(lián)研究顯示，人類染色體9p24是結(jié)直腸癌的一個易感位點[19]，B7-H1基因恰好位于9p24.1，因此，本研究結(jié)果在遺傳學層面是合理的。

鑒于B7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性位于B7-H1基因3′-UTR區(qū)miR-570結(jié)合“種子區(qū)”，C到G的轉(zhuǎn)變破壞了B7-H1基因與miR-570的結(jié)合，影響了B7-H1的表達[8]，由此推測，B7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性增加結(jié)直腸癌發(fā)病風險的可能機制是B7-H1基因rs4143815位點GG基因型通過miR-570調(diào)控B7-H1 mRNA的表達。為驗證該推測，本研究運用定量PCR分析了結(jié)直腸癌組織中B7-H1 mRNA的表達，并分析了其與B7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中B7-H1 mRNA高表達，與以往研究結(jié)果一致[1-4]；并且攜帶B7-H1基因rs4143815位點GG基因型的結(jié)直腸癌患者B7-H1 mRNA表達量明顯高于CC基因型攜帶者。該研究結(jié)果與Xie等[13]在肝癌中觀察到的結(jié)果一致，證實了B7-H1基因rs4143815位點GG基因型增加了B7-H1 mRNA表達進而增加了結(jié)直腸癌的易感性這一假設(shè)。

本研究存在一定的局限性：①樣本例數(shù)較小，可能沒有足夠的檢驗效能；②2012年設(shè)計收集樣本時，未采用問卷調(diào)查，遺失一些重要信息，例如遺傳結(jié)構(gòu)分析等。未來有必要開展設(shè)計嚴密、大樣本、多群體的前瞻性研究驗證本研究結(jié)果。

綜上所述，B7-H1基因miR-570結(jié)合位點rs4143815的GG基因型增加了中國漢族人群結(jié)直腸癌的發(fā)病風險，可能機制是增加了B7-H1 mRNA的表達，提示B7-H1基因rs4143815位點多態(tài)性有望作為新的靶點用于結(jié)直腸癌免疫治療。